姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞的抗腫瘤作用及其分子機制

鄧　姍，楊興斌，王　寧，劉亞菲（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710119）

姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞的抗腫瘤作用及其分子機制

鄧姍，楊興斌*，王寧，劉亞菲
（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710119）

在本實驗中，通過MTT法和LDH法檢測姜黃素對MCF-7細胞抗腫瘤和毒性作用，通過流式細胞儀的分析揭示了姜黃素對細胞周期、細胞凋亡、線粒體膜電位（△ψm）的影響，利用caspase試劑盒來檢驗caspase的活性以及用western blot法檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2、PARP、細胞色素c的表達。結果顯示姜黃素對MCF-7細胞有抗腫瘤以及毒性作用；姜黃素能使MCF-7阻滯在G0/G1期，可以誘導細胞凋亡。在姜黃素作用下細胞的線粒體膜電位（△ψm）增加，caspase-3、caspase-9、Bax、PARP蛋白表達上調，同時細胞色素c從線粒體釋放到細胞液中，而Bcl-2的表達減少。這些結果表示姜黃素可以通過使MCF-7細胞的周期阻滯在G0/G1期和通過線粒體途徑誘導的凋亡兩方面來引起對乳腺癌MCF-7細胞的抗腫瘤作用。

姜黃素，抗腫瘤作用，細胞周期，細胞凋亡，線粒體

姜黃素是一種從姜科植物姜黃中提取的多酚色素，具有強烈的抗氧化、抗突變和抗癌特性［1-2］。近年的研究發(fā)現，姜黃素可預防化學性和放射性物質誘導的實驗動物的食道癌、胃癌等多種腫瘤的形成，并可抑制多種體外建株腫瘤細胞的生長［3-4］。但是有關對MCF-7細胞的作用研究較少，特別是分子機制方面研究很少［1-3］。本實驗主要通過MTT法、LDH法，觀察姜黃素對MCF-7細胞生長、細胞周期、細胞凋亡的作用，并首次通過western blot的方法對細胞凋亡的機制進行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳腺癌MCF-7細胞、正常乳腺細胞H184B5F5/ M10北京協(xié)和醫(yī)院；姜黃素武漢試劑公司，95%；小牛血清、RPMI-1640基本培養(yǎng)基、LDH測定試劑盒、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、caspase-3試劑盒、caspase-9試劑盒美國gibco公司產品；二甲基亞砜（DMSO）、五氟尿嘧啶（5-Fu）、胰蛋白酶、3-（4，5-二甲基噻挫-2）-2，5-二苯基四氮挫溴鹽（MTT）、4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、核糖核酸酶（RNase）、碘化丙啶（PI）、羅丹名123（RH123）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜） 美國Sigma公司；Bax、Bcl-2、PARP、細胞色素c的一抗以及相應的二抗美國艾美捷有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）自配；抗體稀釋液（PBST）、EDTA、NaHCO3及其他試劑均為分析純。

SCO型CO2恒溫培養(yǎng)箱、ESCO型超凈工作臺新加坡藝思高科技有限公司；MR23i高速低溫離心機法國Jouan公司；酶標儀、TU-1810型紫外分光光度計北京普析通用公司；IX51型倒置顯微鏡日本Olympus公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細胞采用含10%小牛血清的RMPI-1640細胞培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內，待其貼壁生長至70%～80%時，用0.05%胰蛋白酶消化傳代［1］。

1.2.2姜黃素對MCF-7細胞增殖的抑制作用采用MTT方法，分別取乳腺癌MCF-7和正常乳腺細胞H184B5F5/M10對數生長細胞接種于96孔板上，在5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，分別用不同濃度的姜黃素作用于細胞，每組設6個復孔，以含相同濃度DMSO的培養(yǎng)液為對照，分別于培養(yǎng)12、24、48 h后每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL SDS，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔570 nm波長光吸收值并記錄結果，每組實驗重復3次。

癌細胞存活率（%）=1-［（1-試驗組平均吸光度A值/對照組平均吸光值A值）×100］［5］

1.2.3姜黃素對MCF-7細胞的毒性作用乳腺癌MCF-7細胞和正常乳腺細胞H184B5F5/M10用不同濃度姜黃素作用后，用LDH實驗［5］測定細胞毒性，分光光度計在450 nm波長檢測。通過檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，確定姜黃素對細胞的毒性［5］。

1.2.4流式細胞儀測定細胞周期分別取乳腺癌MCF-7對數生長細胞接種于6孔板上，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，分別用0、50、100 μmol/L姜黃素作用于細胞，細胞被收集后，用70%乙醇-20℃下固定過夜，過夜后加入1 mL PBS和10 μL RNase室溫下培養(yǎng)30 min，再加入10 μL PI培養(yǎng)30 min，最后用流失細胞儀對處理好的細胞進行周期測定［6］。

1.2.5細胞的凋亡情況的測定取對數期MCF-7細胞接種于6孔板上，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，分別用0、50、100 μmol/L姜黃素作用于細胞，培養(yǎng)24 h后，利用胰蛋白酶對細胞進行消化，然后離心，根據Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒上的說明進行實驗操作，利用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況［7］。

1.2.6線粒體膜電位（△ψm）的測定利用染色劑Rh123對處理后的細胞進行染色，然后通過流式細胞儀進行測定。將分別用0、25、50、100 μmol/L姜黃素處理的細胞加入1 mmol/L Rh123，然后在37℃條件下培養(yǎng)30 min，處理好的細胞利用流式細胞儀來測定細胞的線粒體膜電位（△ψm）［8］。

1.2.7caspase-3和caspase-9活性的確定通過caspase試劑盒對caspase-3和caspase-9的活性進行測定，分別將0、25、50、100 μmol/L的姜黃素處理過的細胞在冰上用裂解液裂解15 min，進行13000 r/min 30 min離心，取上清液，然后在96孔板中于每20～40 μg蛋白中加入90 μL相應的探針和10 μL相應的催化酶，37℃下培養(yǎng)2 h，最后通過酶蛋白儀測定樣品的吸光值來確定caspase-3和caspase-9的活性［9］。

1.2.8Western Blot檢測細胞蛋白表達利用western blot方法檢測相關目的蛋白的表達情況。取對數期MCF-7細胞，制成3×105個/mL單細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，給予0、50、100 μmol/L的姜黃素處理，繼續(xù)孵育24 h后，收集細胞。將以上處理好的細胞進行蛋白收集，然后按照BCA試劑盒的方法對蛋白進行定量分析，定量好的蛋白進行12%SDS-PAGE，上樣蛋白量25 μg/孔；濃縮電壓80 V，30 min，分離電壓100 V，1.5 h。將電泳后的凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，在雜交袋中與相對應的一抗（一抗工作濃度均為1∶1000）4℃孵育過夜。一抗孵育結束后用PBST洗膜3次，每次10 min。與相應來源的二抗在雜交袋中室溫孵育1 h。孵育結束后用PBST洗膜三次，每次10 min。之后用ECL發(fā)光液在暗室曝光并壓片［9］。

1.3數據分析與處理

實驗數據以mean±SD表示，所有數據均為三次重復實驗的平均值，使用Excel軟件以及SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行分析處理。

2　結果與分析

2.1姜黃素對MCF-7存活率的影響

圖1所示為姜黃素作用于人乳腺癌MCF-7細胞12、24、48 h后細胞存活率變化情況。該圖表示姜黃素抑制MCF-7細胞的增長，并且一直呈現濃度劑量效應和時間劑量效應。姜黃素濃度12.5、25、50、100 μmol/L作用MCF-7細胞24 h后，對MCF-7細胞有明顯的抑制作用；但是相同濃度的姜黃素對正常乳腺上皮細胞H184B5F5/M10，并沒有觀察到與MCF-7相同的抑制作用（圖2）。MTT的結果顯示姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞有明顯的抗腫瘤作用。

圖1　不同濃度姜黃素對MCF-7細胞存活率的影響Fig.1　Effect of concentrations of CUR on the MCF-7 cells proliferation

圖2　不同濃度姜黃素對H184B5F5/M10細胞存活率的影響Fig.2　Effect of concentrations of CUR on the H184B5F5/M10 cells proliferation

2.2姜黃素對MCF-7細胞毒性的影響

圖3　不同濃度姜黃素對MCF-7和H184B5F5細胞LDH的影響Fig.3　Effect of concentrations of CUR on the MCF-7 cells and H184B5F5 LDH activities

如圖3所示，在12.5、25、50、100 μmol/L姜黃素作用下，隨著姜黃素組分濃度的增大，胞外LDH的活性越強，即樣品對腫瘤細胞的毒性作用越強，結果顯示姜黃素的細胞毒性作用依舊隨其濃度的上升而上升。同時由圖3可知100 μmol/L姜黃素作用MCF-7細胞的效果和50 μmol/L 5-Fu作用癌細胞的效果相似，但是和MTT一樣，當用姜黃素對正常細胞H184B5F5/ M10作用時，則沒有類似的效果，結果顯示，姜黃素對人乳腺癌細胞MCF-7有較強的細胞毒效應，且有量效依賴關系。

2.3姜黃素對MCF-7細胞細胞周期的影響

為了闡明姜黃素對MCF-7細胞的生長抑制作用是否與細胞周期阻滯有關，分析了姜黃素對細胞周期的影響。如圖4，細胞周期實驗結果顯示，姜黃素對MCF-7細胞周期有一定的阻滯作用。當姜黃素以濃度0、50、100 μmol/L作用MCF-7細胞，G0/G1期的細胞由42.9%上升到58.3%、65.8%。同時在S期的細胞由控制組的50.4%下降到41.6%、4.2%，而G2/M相對于其他兩組的變化不明顯。因此，該細胞周期實驗表明，姜黃素對MCF-7周期有阻滯作用，將細胞周期阻滯在G0/G1期。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法定量檢測細胞凋亡結果

細胞凋亡是一個主動的程序性死亡過程，被多細胞生物用來去除不需要的、異常的或具有潛在危害性的細胞，是維持體內細胞數量動態(tài)平衡的基本措施。為了對姜黃素引起MCF-7細胞凋亡進行定量分析，采用Annexin V-FITC/PI雙染法分析細胞經姜黃素處理后的凋亡情況。如圖5所示Annexin V/PI凋亡雙染法對姜黃素引起MCF-7細胞凋亡的定性定量結果。從圖5中可看出，經0、50、100 μmol/L姜黃素處理24 h的MCF-7細胞出現了3.9%、27.6%、54.1%的凋亡。在50、100 μmol/L姜黃素處理細胞24 h，在出現早期凋亡的同時，伴隨有3.7%、11.3%的晚期凋亡。與陽性對照組（5-Fu）相比有明顯的效果。綜合LDH實驗結果，可以認為姜黃素在誘導MCF-7細胞凋亡的同時，伴隨有少量的細胞壞死。因為壞死細胞數占很少數，故不做深入研究。

2.5線粒體膜電位（△ψm）的檢測結果

大量研究顯示，在各種因素誘導細胞凋亡的過程中，均出現線粒體功能的紊亂，尤其是線粒體跨膜電位（△ψm）的破壞。為了探究姜黃素引起的MCF-7細胞凋亡是否與線粒體有關，本實驗用RH123檢測線粒體膜電位。RH123是一種可以穿透細胞膜的陽離子熒光染料，可以作為線粒體跨膜電位的指示劑。正常情況下，RH123依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，當細胞凋亡時，線粒體膜電位崩塌，RH123被重新釋放出線粒體基質，且因為可以穿透細胞膜，會重新釋放出細胞，導致熒光強度下降。圖6為流式細胞儀結合RH123檢測經不同濃度姜黃素處理后MCF-7細胞線粒體膜電位結果。M1所示為低電位水平，如圖6所示，0、25、50、100 μmol/L姜黃素處理MCF-7細胞24 h后，線粒體膜低電位由原來的4.1%上升至9.9%、17.4%和49.6%。結果表明，姜黃素誘導的MCF-7細胞凋亡過程中，出現了線粒體膜電位下降的現象。

2.6線粒體相關蛋白的表達情況

線粒體膜電位的檢測結果顯示，姜黃素引起了MCF-7細胞線粒體膜電位的崩塌，暗示線粒體參與了姜黃素誘導的MCF-7細胞凋亡過程，即線粒體凋亡途徑。Bax和Bcl-2是被認為在線粒體路徑凋亡過程中重要的蛋白，繼而導致線粒體釋放細胞色素c，形成凋亡小體而啟動caspase-9活化。最后，死亡執(zhí)行因子caspase被活化，通過蛋白酶水解而使細胞崩潰。圖7表明通過caspase試劑盒對caspase-3和caspase-9的活性進行檢測時，caspase-3和caspase-9都相應地被活化。而圖8Western blot結果表明：促凋亡蛋白Bax在50、100 μmol/L姜黃素作用24 h后，表達顯著升高；抑制凋亡蛋白Bcl-2在同樣的條件下，表達下降（Bax/bcl-2的比值明顯變化）；同時在線粒體中的細胞色素c降低，而相應的在細胞質中細胞色素c增加也被觀察到；PRRP蛋白在姜黃素作用24 h后，表達增強。這些蛋白表達變化表明，姜黃素誘導MCF-7細胞凋亡和線粒體途徑有關。

圖5　不同濃度姜黃素對MCF-7細胞凋亡的影響Fig.5　Effect of concentrations of CUR on MCF-7 cell apoptosis

圖6　不同濃度姜黃素對MCF-7細胞內線粒體膜電位（△ψm）的影響Fig.6　Effect of concentrations of CUR on mitochondrial membrane potential（△ψm）in MCF-7 cells

圖7　不同濃度姜黃素對MCF-7細胞中caspase蛋白表達的影響Fig.7　Effect of concentrations of CUR on the expression of caspase proteins in MCF-7 cells

圖8　不同濃度姜黃素對MCF-7細胞中細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.8　Effect of concentrations of CUR on the expression of apoptosis-related proteins in MCF-7 cells

3　討論

姜黃為姜黃屬植物，其根莖入藥，是一種藥食兩用的食物。實驗證明，姜黃素具有確切的抗腫瘤活性，其抗癌譜較廣、不良反應小，是一種具有廣泛應用前景的抗腫瘤新藥。本實驗觀察到姜黃素對人乳腺癌細胞株MCF-7具有明顯的增殖抑制作用，并呈時間、劑量依賴關系（圖1）。這與文獻報道［10］姜黃素可抑制人乳腺癌細胞增殖的結果一致。用不同濃度的姜黃素處理MCF-7細胞，相對于控制組的細胞出現了明顯的早凋和晚凋的情況，由此可見姜黃素可引起MCF-7細胞的凋亡（圖5）。另一方面，就姜黃素對細胞周期的影響來看，姜黃素對MCF-7細胞的作用主要在G0/G1期阻滯，使細胞無法進入下一增殖周期（圖4），這與之前的研究結果是一致的［2］。由本實驗可以明確看到在0、50、100 μmol/L姜黃素處理細胞時，G0/G1期細胞逐漸增加，而S期細胞逐漸減少，同時G2/M期細胞沒有明顯的變化。因此，姜黃素通過影響細胞周期分布而影響細胞的代謝和功能，導致細胞重新分化，達到抑制細胞增殖的目的。這可能是其抗腫瘤機制的另一方面。

本實驗研究了姜黃素影響細胞凋亡的機制，最主要是從線粒體方面來研究細胞的凋亡。線粒體被認為與細胞凋亡的發(fā)生有重要的關系，研究線粒體的損傷與癌癥治療有著重要的關系。在細胞凋亡的內部通路中，主要是以線粒體為核心成分，然后去激活腫瘤細胞凋亡以及DNA損傷等。同時，任何異常細胞信號都有可能引起促凋亡蛋白（Bax）活化［11］，繼而導致線粒體釋放細胞色素c，形成凋亡小體而啟動caspase-9活化，從而導致caspase-3的活化，通過蛋白酶水解而使細胞崩潰，最終引起細胞的凋亡［12］。該凋亡通路可被各種抗凋亡蛋白，如Bcl-2等凋亡抑制因子所調控［13］。當前，關于抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax的研究報道已有很多，尤其是Bax/Bcl-2比例的改變更能說明二者在細胞凋亡中的作用［14］。線粒體的功能障礙可能是細胞發(fā)生凋亡的信號，線粒體膜電位的減少以及細胞色素c由線粒體釋放到細胞液中，被認為線粒體發(fā)生功能障礙最重要的指標［15］。正如圖6顯示，本實驗利用RH123染色法對細胞的線粒體膜電位進行檢測。在對用0、25、50、100 μmol/L姜黃素處理的細胞進行膜電位檢測時，可以明顯發(fā)現姜黃素能夠誘導線粒體膜電位的破壞。利用caspase試劑盒對caspase進行測定，由圖7可知直接參與線粒體凋亡途徑的caspase，在25 μmol/L姜黃素作用24 h后即被活化了，由圖7可知伴隨其水解產物caspase-9含量升高；caspse-3也出現了和caspse-9同樣的活化情況。由圖8 Western blot實驗結果表明：促凋亡蛋白Bax在0、50、100 μmol/L姜黃素作用24 h后，表達顯著升高；同時在姜黃素作用24 h后，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降（Bax/Bcl-2的比值明顯變化）；同時也發(fā)現了細胞色素c由線粒體釋放到細胞液中。這些蛋白表達變化表明，姜黃素誘導MCF-7細胞凋亡和線粒體途徑有關。

本研究證實了姜黃素對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用，其增殖抑制效應呈劑量及時間依賴關系，以及姜黃素對細胞周期以及細胞凋亡的影響，并探討了影響細胞凋亡的線粒體的分子機制。實驗結果使姜黃素作為有效以及天然的藥物成為一種可能。

4　結論

不同濃度的姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞有抗腫瘤以及毒性的作用，其作用呈現濃度劑量效應。細胞周期實驗證明了姜黃素能夠將MCF-7細胞阻滯在G0/G1期，同時通過對線粒體膜電位（△ψm）和線粒體相關凋亡蛋白表達檢測的結果表示：姜黃素能夠通過線粒體路徑促進MCF-7細胞的凋亡。

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Inhibitory effect and molecular mechanisms of curcumin against human breast cancer MCF-7 Cells

DENG Shan，YANG Xing-bin*，WANG Ning，LIU Ya-fei
（Colleage of Food Engineering and Nutritional Science，Shanxi Normal Unversity，Xi’an 710119，China）

In this study，cytotoxic effect and antiproliferative activity was detected by LDH assay and MTT assay. The effect of curcumin on cell cycle，apoptosis，mitochondrial membrane potential（△ψm）was analysed by flow cytometry.The caspase-3 and caspase-9 activities were assessed by caspase assay kit according to the manufacturer’s instruction.The expression patterns of pro-apoptotic and anti-apoptotic Bcl-2 family proteins，cytochrome c，and PARP in curcumin treated MCF-7 cells were investigated by western blot.The results showed that curcumin had a markedly antiproliferative and cytotoxic activity against the MCF-7 cells in a dose-dependent manner.It was indicated that curcumin could result in G0/G1 phase and apoptosis of MCF-7 cells.Curcumin increased△ψm，caspase-3，caspase-9，Bax，PARP expression，decreased Bcl-2 expression，and cytochrome c was found to be released from mitochondria to the cytosol.These results showed that curcumin exhibit anti-proliferation of human breast cancer MCF-7 cells via cell cycle arrest at the G0/G1 phase and apoptosis induced by mitochondrial pathway.

curcumin；antitumor effect；cell cycle；apoptosis；mitochondria

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0362-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.065

2014－10－27

鄧姍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)學，E-mail：976524323@qq.com。

楊興斌（1969-），男，教授，主要從事食品科學與營養(yǎng)研究方面的研究，E-mail：xbyang@snnu.edu.cn。

國家自然科學基金項目C31171678。