ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的復(fù)合誘變篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

吳晨奇，扶教龍，2，*，陳冬銓，錢大偉，李良智，2，胡翠英，王桃云（.蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州25009；2.蘇州市新能源與低碳技術(shù)重點實驗室，江蘇蘇州25009）

ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌的復(fù)合誘變篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

吳晨奇1，扶教龍1，2，*，陳冬銓1，錢大偉1，李良智1，2，胡翠英1，王桃云1
（1.蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州215009；2.蘇州市新能源與低碳技術(shù)重點實驗室，江蘇蘇州215009）

以白色鏈霉菌FQ-9為出發(fā)菌株，首次利用（甘氨酸+L-賴氨酸+磺胺胍）復(fù)合抗性，進行“紫外-氯化鋰”復(fù)合誘變，篩選出一株ε-PL產(chǎn)量達（0.668±0.0045）g/L的突變菌株FQC-23，產(chǎn)量提高了15.37%，且其遺傳性穩(wěn)定。然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，最終確定最佳培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖46.1、酵母粉13.0、（NH4）2SO45.9、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO40.8、KH2PO41.36、FeSO4·7H2O 0.03、ZnSO4·7H2O 0.04，在此條件下，F(xiàn)QC-23的ε-PL產(chǎn)量達（1.090±0.0041）g/L，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高了87.56%。

ε-聚賴氨酸，抗性平板，誘變，響應(yīng)面分析方法，白色鏈霉菌

ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種由L-賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基連接而成的微生物源線性多聚物，它可用作食品防腐劑，具有抑菌譜廣、安全性能高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，這使它成為目前最具潛力的生物防腐劑［1］。ε-PL已在美國、日本和韓國等地被廣泛使用，而我國也批準(zhǔn)了ε-PL可用作食品添加劑。此外，ε-PL還可用作載體材料、可降解性材料和高吸水性聚合材料等［2］。因此，ε-PL具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，研究人員在ε-PL高產(chǎn)菌的篩選及育種方面做了大量的研究。然而，ε-PL產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力依然較低，這在一定程度上制約了對它進一步的研究和利用。通過遺傳改良來獲得高產(chǎn)菌株，是提高ε-PL產(chǎn)率的關(guān)鍵，國內(nèi)外研究者主要是通過物理或化學(xué)方法（UV、NTG、DES、亞硝酸等）對菌種進行誘變，并結(jié)合對產(chǎn)物（ε-PL）或代謝中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物（如AEC、AHV）等的耐受進行高產(chǎn)菌種的篩選［3-7］。但從這些研究可以發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)ε-PL產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力與日本相比還存在一定差距，因此在育種方面還需進行深入的研究。微生物代謝控制育種是通過遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過正常代謝途徑的突變株，從而選擇性地大量合成積累有用產(chǎn)物的方法［8］?；诖耍狙芯恳园咨溍咕鶩Q-9為出發(fā)菌株，應(yīng)用微生物代謝控制育種與物理復(fù)合誘變相結(jié)合的方法對其進行誘變篩選，并采用單因素與響應(yīng)面結(jié)合的方法，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以進一步提高ε-PL發(fā)酵水平。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）FQ-9由本實驗室保藏；甲基橙、甘氨酸（Gly）、L-賴氨酸（LLys）、磺胺胍（SG）、酵母粉AR，阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖、硫酸銨、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4等AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、瓊脂粉BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；ε-PL標(biāo)準(zhǔn)品南京工業(yè)大學(xué)徐虹教授惠贈。

UV-2450紫外-可見光分光光度計日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司；UNE500滅菌烘箱德國MEMMERT公司；SW-CJ-2FD超凈臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；TS-2102型搖床上海天呈科技有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；實驗室常規(guī)儀器。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制

1.2.1.1貝特納斜面培養(yǎng)基葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L，pH7.5，115℃滅菌20 min。

1.2.1.2Gly、L-Lys和SG抗性平板葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，瓊脂15 g，一定量的Gly，L-Lys和SG，加水定容至1 L，pH7.5，115℃滅菌20 min。

1.2.1.3種子和發(fā)酵培養(yǎng)基（M3G）葡萄糖50 g，酵母粉5 g，（NH4）2SO410 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.8 g，KH2PO41.36 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，ZnSO4·7H2O 0.04 g，加水定容至1 L，pH6.8，115℃滅菌20 min。

1.2.2培養(yǎng)方法

1.2.2.1斜面及平板培養(yǎng)單孢子懸液涂布于貝納特斜面培養(yǎng)基或抗性平板，30℃恒溫培養(yǎng)5～6 d形成孢子，保藏備用。

1.2.2.2種子培養(yǎng)250 mL的三角瓶中裝液50 mL，接入一環(huán)孢子，200 r/mim，30℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)250 mL的三角瓶中裝液50 mL，按10%接種量接入種子液，200 r/mim，30℃培養(yǎng)72 h。

1.2.3指標(biāo)的測定

1.2.3.1ε-PL產(chǎn)量測定方法參照Itzhaki F R方法［9］。

1.2.3.2致死率計算方法致死率（%）=［（對照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)］×100

1.2.3.3致死率偏差計算方法致死率偏差=－|致死率－80%|，致死率偏差越接近于零，表明此時致死率越接近80%，負號表明作三維響應(yīng)面圖時開口朝下。

1.2.4單孢子懸浮液制備用無菌生理鹽水洗下S.albulus斜面上成熟的孢子，制成孢子懸液，然后轉(zhuǎn)移至含有玻璃珠的無菌三角瓶中，經(jīng)充分振蕩，使孢子打散后，用八層紗布進行過濾，即得單孢子懸液。

1.2.5抗性平板中Gly、L-Lys和SG濃度的確定

1.2.5.1單一抗性物質(zhì)對單菌落生長的影響將0.1 mL出發(fā)菌株的單孢子懸液涂布于含有不同抗性物質(zhì)，不同設(shè)計水平的抗性平板上，每個處理做三個平行，進行平板培養(yǎng)，觀察平板上菌落的生長情況，以確定抗性平板中Gly、L-Lys和SG的濃度。其中Gly添加濃度（g/L）：0、1.5、3、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、10、12、14、16，其他同斜面培養(yǎng)基；L-Lys添加濃度（g/L）：0、0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6、1.9、2、2.5、3、4，其他同斜面培養(yǎng)基；SG添加濃度（g/L）：0、1.5、4、6.5、9、11.5、14，其他同斜面培養(yǎng)基。

1.2.5.2復(fù)合抗性的濃度優(yōu)化實驗在單因素抗性篩選實驗的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化Gly、L-Lys和SG三者的復(fù)合濃度。以Gly、L-Lys和SG為三種篩選因子，以致死率偏差為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計方法并利用Design-Expert 8.0.6軟件［10］，設(shè)計三因素三水平實驗，其因素與水平設(shè)計見表1，優(yōu)化復(fù)合抗性濃度。

表1　Box-Behnken實驗因素與水平Table 1　Variable and levels of response surface Box-Behnken design

1.2.6誘變方法

1.2.6.1紫外（UV）復(fù)合氯化鋰誘變?nèi)捂咦討乙? mL，加入到9 cm直徑的無菌培養(yǎng)皿中，在紫外誘變箱內(nèi)距15 W紫外燈30 cm處進行攪拌照射誘變，在紅光下稀釋涂布固體平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加0.5%的LiCl作為助誘變劑［11］，避光平板培養(yǎng)。

1.2.6.2初篩紫外復(fù)合氯化鋰誘變后，涂布于復(fù)合抗性平板上，平板培養(yǎng)后，從平板中挑取表面粗糙干燥、呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則形、孢子量大且豐滿的單菌落，接入到斜面培養(yǎng)基中，斜面培養(yǎng)，4℃冰箱中保藏用于復(fù)篩［12］。

1.2.6.3復(fù)篩將初篩得到的菌株逐個進行搖瓶發(fā)酵，測定其ε-PL產(chǎn)量。

1.2.7菌株遺傳穩(wěn)定性實驗將篩選出的高產(chǎn)菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接6代，并進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定ε-PL的產(chǎn)量，檢測菌株遺傳性狀。

1.2.8發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.8.1發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素實驗本實驗選擇了培養(yǎng)基中對發(fā)酵影響較大的三種成分：葡萄糖、酵母粉和硫酸銨，分別考察其不同濃度對誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)ε-PL的影響。其中，選擇葡萄糖濃度（g/L）為10、20、30、40、50、60、70，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，來選擇最佳的葡萄糖濃度；選擇酵母粉濃度（g/L）為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，來選擇最佳的酵母粉濃度；選擇硫酸銨濃度（g/L）為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12.0，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，來選擇最佳的硫酸銨濃度。

1.2.8.2發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的響應(yīng)面分析實驗根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，選用葡萄糖、酵母粉及硫酸銨為考察因素，采用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計［13］，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，其實驗因子和編碼水平見表2。

表2　Box-Behnken實驗因素與水平Table 2　Variable and levels of response surface Box-Behnken design

1.2.9數(shù)據(jù)處理方法所有實驗做3個平行，Excel進行實驗數(shù)據(jù)誤差分析，Design Expert軟件對響應(yīng)面實驗得到的數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1抗性平板中Gly、L-Lys和SG濃度的確定

目前在篩選ε-PL抗性突變株時，常用的抗性物質(zhì)是AEC與Gly的混合物，但AEC價格昂貴，且用量極大［4，6，14］。研究表明，L-Lys是ε-PL的合成前體，能直接被ε-PL生物合成所利用［15-16］；此外，SG是β-氨基安息香酸的結(jié)構(gòu)類似物，SG抗性可以解除天冬氨酸對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的反饋抑制作用［16］。選育SG抗性突變株，可增強L-Lys前體天冬氨酸的合成，從而提高L-Lys的代謝流，進而提高ε-PL的產(chǎn)量。

因此，本文選擇Gly、L-Lys和SG這三種抗性物質(zhì)，同時添加到抗性平板上，篩選出具有這三種抗性的突變株。實驗首先須確定Gly、L-Lys和SG的最佳濃度。

2.1.1單一抗性物質(zhì)對單菌落生長的影響當(dāng)Gly、L-Lys和SG濃度分別為5.5、1.3、4 g/L時，平板中開始出現(xiàn)少量不長孢子的單菌落，但大部分菌落的孢子豐滿且量大，菌落生長良好；當(dāng)Gly、L-Lys和SG濃度分別低于5.5、1.3、4 g/L時，其濃度對出發(fā)菌株的生長基本沒有影響，孢子量大且豐滿；而當(dāng)三個抗性物質(zhì)濃度高于上述添加量時，平板中明顯大多數(shù)單菌落都不長孢子，當(dāng)三種濃度分別達到14、3、9 g/L時，菌株幾乎無法生長。實驗結(jié)果見表3。根據(jù)文獻，高產(chǎn)菌株的特征是孢子量大且豐滿［12］。故本實驗將Gly、L-Lys和SG的濃度分別以5.5、1.3和4 g/L為中心點，以對抗性濃度進行進一步優(yōu)化。

表3　各抗性物質(zhì)對FQ-9的生長影響Table 3　Effect of resistant substance concentration on growth of FQ-9

2.1.2復(fù)合抗性的濃度優(yōu)化實驗結(jié)果實驗中，設(shè)置當(dāng)復(fù)合抗性平板上菌落的致死率越接近80%，復(fù)合抗性平板中三種成分的濃度組成越好。響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4　響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 4　Box-Behnken design and corresponding results

根據(jù)表4的實驗結(jié)果，對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到致死率偏差（R1）對Gly（A1）、L-Lys（B1）、SG（C1）的多項回歸方程為：R1=－0.853＋0.074A1＋0.437B1＋0.143C1－5.819×10-3A1B1－6.617×10-3A1C1－0.021B1C1－2.875A12－0.114B12－7.941×10-3C12，對實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表5所示。

從表5可以看出，模型相關(guān)性系數(shù)R2=0.9974，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9939，這兩個值說明模型的實測值和預(yù)測值有良好的擬合度，能夠較好地解釋響應(yīng)面值的變化。此次實驗的C.V.值為6.64%，說明此次實驗是可信的。而且模型的p值小于0.0001，表明模型極顯著，方程對實驗結(jié)果擬合較好，而失擬項的p值為0.2163，說明失擬項不顯著，殘差有隨機誤差引起，模型是可行的。

表5　回歸系數(shù)檢驗表Table 5　ANOVE analysis for regression equation

通過求解回歸方程，可解出復(fù)合抗性的最佳組成濃度為：Gly 5.95 g/L，L-Lys 1.33 g/L，SG 4.79 g/L，此時致死率偏差為-0.0014，致死率為80%±0.14%?？紤]實際操作的方便，最終三種抗性物質(zhì)的濃度為：Gly 5.95 g/L，L-Lys 1.35 g/L，SG 4.80 g/L，按此濃度進行三次驗證實驗，致死率分別為80.29%、80.29%、79.75%，平均致死率為80.11%±0.25%，與預(yù)測值接近，且在驗證實驗中，單菌落基本都長出豐滿且量大的孢子。實驗結(jié)果表明，應(yīng)用響應(yīng)面方法優(yōu)化三種抗性濃度是可靠的。

2.2紫外誘變

2.2.1紫外線誘變時間的確定取制備好的濃度為108個/mL的FQ-9的單孢子懸液分別振蕩照射0、15、20、30、45、60、75、90、120 s。將照射后的懸液在紅光下進行稀釋，取稀釋液0.1 mL涂布于復(fù)合抗性平板，每個時間做三個平行，同時做對照實驗，避光培養(yǎng)后進行活菌計數(shù)，以照射時間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死率曲線圖，見圖1。

圖1　S.albulus FQ-9紫外誘變致死率曲線Fig.1　The fatality rate curve of Streptomyces albulus FQ-9

由圖1可看出，當(dāng)紫外輻照時間為60 s時，致死率為86.73%±0.325%，接近80%，選擇60 s為紫外誘變處理時間。

2.2.2UV復(fù)合氯化鋰突變株篩選結(jié)果將誘變處理的孢子懸液涂布于含有0.5%LiCl的復(fù)合抗性平板上，避光培養(yǎng)。從平板上挑取40個生長良好的單菌落進行初篩和復(fù)篩，測定ε-PL產(chǎn)量。篩選結(jié)果見圖2，圖中水平虛線為出發(fā)菌株FQ-9的ε-PL產(chǎn)量。

圖2　紫外誘變的篩選結(jié)果Fig.2　Result of UV mutagenesis

從圖2可發(fā)現(xiàn)，有19株突變株的產(chǎn)量得到提高，其中23號菌株FQC-23表現(xiàn)最突出，產(chǎn)量達（0.668± 0.0045）g/L，較FQ-9提高了15.37%，故選取FQC-23進行遺傳穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明，在紫外線、LiCl和復(fù)合抗性物質(zhì)的作用下，正突變率接近50%。

2.2.3遺傳性狀穩(wěn)定性實驗將篩選出的突變株FQC-23在復(fù)合抗性斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接6代，其產(chǎn)孢速度基本一致，ε-PL產(chǎn)量穩(wěn)定，其中第二代的產(chǎn)量為（0.652±0.0038）g/L，第四代為（0.647±0.0015）g/L，第六代為（0.653±0.0015）g/L，ε-PL產(chǎn)量介于0.647～0.653 g/L之間，結(jié)果表明該菌株遺傳性能穩(wěn)定，Gly5.95L-Lys1.35SG4.80復(fù)合抗性標(biāo)記可穩(wěn)定遺傳。

2.3發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1葡萄糖濃度對ε-PL產(chǎn)量的影響由圖3可以看出，隨葡萄糖濃度的增加，ε-PL產(chǎn)量也增加；當(dāng)葡萄糖濃度達到40 g/L時，ε-PL產(chǎn)量達到最大，可達（0.653±0.0055）g/L；而當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)加大時，ε-PL產(chǎn)量反而下降，這表明過大的添加量并不利于ε-PL產(chǎn)量的增大，這可能是由于在發(fā)酵過程中過多葡萄糖容易引起“葡萄糖效應(yīng)”，進而影響菌體生長和代謝產(chǎn)物的形成。故在本實驗的考察范圍內(nèi)葡萄糖最佳濃度為40 g/L。

圖3　葡萄糖濃度對ε-PL產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of glucose concentration on the yield of ε-PL

2.3.2酵母粉濃度對ε-PL產(chǎn)量的影響由圖4可以看出，當(dāng)酵母粉濃度低于10 g/L時，ε-PL產(chǎn)量不斷增加，并達到最大值（0.823±0.0032）g/L，繼續(xù)增加酵母粉的濃度，ε-PL產(chǎn)量反而降低，可能是由于酵母粉成分復(fù)雜，后期底物消耗不完，會誘導(dǎo)產(chǎn)生一些酶降解白色鏈霉菌菌絲體，因此，確定酵母粉最佳濃度為10 g/L。

圖4　酵母粉濃度對ε-PL產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of yeast powder addition on the yield of ε-PL

2.3.3硫酸銨濃度對ε-PL產(chǎn)量的影響由圖5可以看出，當(dāng)硫酸銨濃度為6 g/L時，ε-PL產(chǎn)量達到最大的（0.658±0.0026）g/L，繼續(xù)增加硫酸銨濃度，ε-PL產(chǎn)量反而降低，這表明過多的硫酸銨并不利于ε-PL的形成，只有適宜的濃度才有利于ε-PL形成，故在本實驗的考察范圍內(nèi)，硫酸銨的最佳濃度為6 g/L。

2.3.4響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成

圖5　硫酸銨濃度對ε-PL產(chǎn)量的影響Fig.5　Effect of（NH4）2SO4on the yield of ε-PL

2.3.4.1模型的建立及顯著性檢驗根據(jù)單因素結(jié)果，采用Design-Expert軟件對葡萄糖、酵母粉、硫酸銨進行優(yōu)化，實驗結(jié)果如表6所示。

表6　Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 6　Box-Behnken design and corresponding results

用Design-Expert軟件，對表6進行多元回歸擬合，可以得到ε-PL產(chǎn)量（R2）對葡萄糖（A2）、酵母粉（B2）、硫酸銨（C2）的回歸方程為：R2=1.030＋0.067A2＋0.170B2＋0.028C2＋7.000×10-3A2B2－0.037A2C2－0.018B2C2－0.059A22－0.150B22－0.092C22，對實驗結(jié)果進行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果如表7所示。

從表7可以看出，模型p<0.0001，表明該模型是高度顯著的，方程擬合度較好；同時失擬項的p為0.3293，說明模型失擬不顯著，殘差由隨機誤差引起，模型選擇正確；該方程系數(shù)R2=0.9986，說明方程的擬合程度較好，該模型能較好地預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)基組分與ε-PL產(chǎn)量的關(guān)系；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9967，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述實驗結(jié)果。

2.3.4.2響應(yīng)面優(yōu)化及分析根據(jù)BB實驗設(shè)計結(jié)果做出三維響應(yīng)面（見圖6~圖8），它們分別反映了葡萄糖（A2）、酵母粉（B2）、硫酸銨（C2）這三個因素的兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響。

表7　回歸系數(shù)檢驗表Table 7　ANOVE analysis for regression equation

圖6　葡萄糖和酵母粉對ε-PL產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析圖Fig.6　Response surface plot for the effects of ε-PL production between glucose and yeast powder

葡萄糖和酵母粉對ε-PL產(chǎn)量的影響如圖6所示，當(dāng)葡萄糖濃度一定時，ε-PL產(chǎn)量隨著酵母粉濃度增加而增大，但當(dāng)酵母粉濃度大于13.03 g時，ε-PL產(chǎn)量呈下降趨勢。當(dāng)酵母粉濃度一定時，隨著葡萄糖濃度的增加，開始ε-PL產(chǎn)量也隨之增大，但當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)增大時，ε-PL產(chǎn)量逐漸降低。

圖7　葡萄糖和硫酸銨對ε-PL產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析圖Fig.7　Response surface plot for the effects of ε-PL production between glucose and（NH4）2SO4

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。如圖7所示，葡萄糖與硫酸銨交互作用顯著，等高線葡萄糖的交點多于與硫酸銨的交點，因此葡萄糖、硫酸銨的交互作用中，葡萄糖對ε-PL產(chǎn)量的影響較大，為主效應(yīng)因子。

圖8　酵母粉和硫酸銨對ε-PL產(chǎn)量影響的響應(yīng)面分析圖Fig.8　Response surface plot for the effects of ε-PL production between（NH4）2SO4and yeast powder

酵母粉和硫酸銨對ε-PL產(chǎn)量的影響如圖8所示，當(dāng)硫酸銨濃度一定時，ε-PL產(chǎn)量隨著酵母粉濃度增加呈先增大后降低的趨勢。當(dāng)酵母粉濃度一定時，ε-PL產(chǎn)量先增大后降低，這與圖6和圖7顯示的規(guī)律相同。此外從響應(yīng)面圖可分析得出，在各因素之間的交互影響中，酵母粉對ε-PL產(chǎn)量影響最大，葡萄糖次之，硫酸銨最弱。此結(jié)果與方差分析表所反映出的結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，通過Design-Expert軟件，進行分析計算，可得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖46.16 g/L、酵母粉13.03 g/L，（NH4）2SO45.91 g/L，在此條件下，ε-PL產(chǎn)量的預(yù)測最大值為1.101 g/L?？紤]到實際培養(yǎng)基的配制，最終確定這三個因素的濃度分別為：葡萄糖46.1 g/L、酵母粉13.0 g/L，（NH4）2SO45.9 g/L。

2.3.4.3優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證為了驗證實驗結(jié)果的可靠性，按上述最終培養(yǎng)基參數(shù)進行驗證實驗，三次重復(fù)實驗的ε-PL產(chǎn)量分別為1.090、1.095 g/L及1.085 g/L，平均值為（1.090±0.0041）g/L，與預(yù)測值只相差1%，表明此模型是可行有效的，并具有一定的實踐參考價值。

3　結(jié)論

采用紫外-氯化鋰復(fù)合誘變，結(jié)合Gly-L-Lys-SG三種抗性的代謝控制育種方法，篩選獲得了一株ε-PL高產(chǎn)菌株Gly5.95L-Lys1.35SG4.80-FQC23，其產(chǎn)量為（0.668±0.0045）g/L，遺傳穩(wěn)定性良好，比出發(fā)菌株提高15.37%。并在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用BB實驗設(shè)計，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過響應(yīng)面法對實驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化與評價，得到影響ε-PL產(chǎn)量的二次多項式回歸模型，并對該模型進行顯著性檢驗。最終得到優(yōu)化的培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖46.1，酵母粉13.0，（NH4）2SO45.9，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.8，KH2PO41.36，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，在此條件下，ε-PL產(chǎn)量達1.101 g/L，重復(fù)驗證測得ε-PL產(chǎn)量為（1.090±0.0041）g/L，兩者相對偏差小于5%。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化白色鏈霉菌培養(yǎng)基組成穩(wěn)定可行。綜上所述，代謝控制育種方法和響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基都為后續(xù)進一步深入研究打下了良好的基礎(chǔ)。同時，也可為其他菌種的選育提供一定參考借鑒。

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Breeding of ε-poly-L-lysine producing strain with combined mutation and the optimization of its fermentation medium

WU Chen-qi1，F(xiàn)U Jiao-long1，2，*，CHEN Dong-quan1，QIAN Da-wei1，LI Liang-zhi1，2，HU Cui-ying1，WANG Tao-yun1
（1.School of Chemistry Biology and Material Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China；2.Key Laboratory of New Energy and Low-carbon Technology of Suzhou City，Suzhou 215009，China）

Using Streptomyces albulus FQ-9 as the initial strain mutated by UV combined with LiCl，and using glycine+sulfaguanidine（SG）+L-lysine as selective markers.Then，a ε-PL-producing strain，Streptomyces albulus FQC-23 of the yield improved to（0.668±0.0045）g/L was screened，which was 15.37%higher than that of FQ-9.Moreover，based on single factor experiment，the fermentation medium of ε-PL producing strain FQC-23 were optimized by response surface methodology，and finally determined the optimal fermentation medium as follows（g/L）：glucose 46.1，yeast powder 13.0，（NH4）2SO45.9，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.8，KH2PO41.36，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04.Under the optimized medium，the yield of ε-PL reached（1.090± 0.0041）g/L and increased by 87.56%compared with the previous condition.

ε-poly-L-lysine；resistant medium plate；mutation；response surface methodology；Streptomyces albulus

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0186-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.029

2014－12－22

吳晨奇（1989-），男，碩士研究生，研究方向：生物化工、食品微生物，E-mail：612324wcq@163.com。

扶教龍（1969-），男，副教授，主要從事生物化工、發(fā)酵工程方面的研究，E-mail：jlfu999@126.com。

蘇州市科技計劃項目（SYN201317）；蘇州科技學(xué)院科研基金項目（XKZ201411）。