超聲波-酶法提取牛跟腱膠原蛋白

張?jiān)气P

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西 太原 030008）

超聲波-酶法提取牛跟腱膠原蛋白

張?jiān)气P

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西 太原 030008）

分別采用胃蛋白酶法與超聲波-酶法提取牛跟腱膠原蛋白，比較了兩種方法膠原蛋白的產(chǎn)率，并對(duì)膠原蛋白進(jìn)行光譜測(cè)試。實(shí)驗(yàn)證明，超聲波酶法的產(chǎn)率明顯較高。

超聲波；提取；紅外 光譜；紫外光譜

世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，需要新型的能源來代替化石燃料，其中生物質(zhì)資源是一種很不錯(cuò)的清潔能源，膠原就是一種可再生的動(dòng)物生物質(zhì)清潔能源。膠原是動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，膠原的排列方式對(duì)維護(hù)組織和細(xì)胞的狀態(tài)、結(jié)構(gòu)完整和強(qiáng)度起到及其重要的作用［1］。

超聲波輻射作為一種促進(jìn)傳質(zhì)的方法，被應(yīng)用于提取、共混和染色中［2-5］，主要的機(jī)理是迅速形成和破裂的空化泡形成熱效應(yīng)、化學(xué)作用、機(jī)械效應(yīng)［6］。但是，空化形成的高溫高壓，容易使蛋白質(zhì)變質(zhì)。一些學(xué)者指出，控制超聲波頻率和功率，一些酶的活性會(huì)得到提高，因此，超聲波和酶的組合在酚類降解［7］、廢水處理［8］、紡織等方面得到廣泛的應(yīng)用。不過，超聲波對(duì)酶的活性影響方面的研究還非常欠缺。

本文分別用胃蛋白酶法與超聲波輔助酶法提取牛跟腱膠原蛋白，在相同條件下，比較兩者的提取率，并將兩種方法得到的膠原蛋白進(jìn)行紅外和紫外測(cè)試，對(duì)膠原蛋白進(jìn)行鑒定。主要目的是研究溫和的超聲波對(duì)生物大分子的影響，并探明超聲波是否可以作為一種提高膠原酶提得率的有效手段。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器

牛跟腱（bovine tendon），胃蛋白酶（1∶3000），其他試劑均為分析純。

FA2104型電子天平，JB300D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)，智能磁力攪拌機(jī)，KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器，Spectrum 100型FT-IR紅外光譜儀，TU1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)。

1.2實(shí)驗(yàn)操作

1.2.1預(yù)處理

將買來的新鮮牛跟腱清洗干凈，并且除去附著在牛跟腱表面的白色黏膜后，再次清洗干凈，切成小于5mm的小塊，倒于燒杯中，用1mol·L-1的氯化鈉溶液持續(xù)攪拌24h，除去跟腱中的鹽溶性雜質(zhì)以及其他的可溶性雜質(zhì)，再用去離子水清洗數(shù)次。再將處理后的牛跟腱用丙酮溶液進(jìn)行浸泡，時(shí)間為12h，丙酮具有毒性而且易于揮發(fā)，此步驟應(yīng)放入通風(fēng)櫥操作，加入丙酮的目的是除去跟腱中的脂類物質(zhì)，浸泡之后取出并將其清洗干凈，放在室溫下自然風(fēng)干，待用。

1.2.2胃蛋白酶提取法

其中，Vc是膠原提取液的體積，mL；Cc是通過紫外法測(cè)得的膠原提取液的濃度， g·mL-1；Wt是提取使用的牛跟腱的重量，g。每次測(cè)試都進(jìn)行2～3次重復(fù)。

1.2.3超聲波-胃蛋白酶提取法

膠原的超聲波-胃蛋白酶法提取過程中，提取裝置放在具有超聲波發(fā)生器和可以控溫的水浴中。用溫度計(jì)對(duì)水浴的溫度進(jìn)行檢測(cè)。為了防止超聲空化作用引起提取液過熱現(xiàn)象，在提取的3d時(shí)間里超聲波采取運(yùn)行30min暫停30min的方式。提取過程除了增加超聲波輻照外，其他步驟與胃蛋白酶法相同。

1.2.4紫外測(cè)試

打開雙光束紫外分光光度計(jì)，并預(yù)熱0.5h，備好待測(cè)樣品，準(zhǔn)備測(cè)試。將提取好的膠原蛋白用0.5M的醋酸溶液進(jìn)行溶解，配置成一定濃度的溶液，配置好的溶液必須為澄清狀態(tài)。用配置好的溶液及醋酸溶液潤(rùn)洗比色皿2～3次，將兩種溶液裝入比色皿中，按照順序依次放到儀器中進(jìn)行測(cè)試。打開軟件進(jìn)行測(cè)定，將得到的紫外譜圖仔細(xì)分析，找出最大的吸收波長(zhǎng)。膠原溶液濃度的定量檢測(cè)是在濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的參照下進(jìn)行的。

1.2.5紅外測(cè)試

打開紅外測(cè)試儀的開關(guān)，并且預(yù)熱0.5h左右，等待測(cè)試。將干燥好的膠原蛋白從培養(yǎng)皿中取出來一些，小心放到紅外測(cè)試儀中進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)范圍400～4000cm-1，檢測(cè)帶寬4cm-1。完成后將放藥品的地方擦拭干凈。對(duì)得到的譜圖進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲處理對(duì)料液溫度的影響

將預(yù)處理好的牛跟腱放入超聲波清洗器中，并且設(shè)定溫度20℃，溫度不要太高，以免膠原蛋白發(fā)生變質(zhì)，頻率為40Hz，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為8h，超聲波采取運(yùn)行30min暫停30min的方式。

表1　超聲波處理牛跟腱溫度變化

在對(duì)牛跟腱進(jìn)行超聲波處理時(shí)，由于超聲波具有機(jī)械效應(yīng)與空化效應(yīng)，所以會(huì)使超聲波清洗器中水的溫度升高，從而使燒杯內(nèi)的溫度也升高，但是只要不超過膠原蛋白的變質(zhì)溫度就可以。

2.2膠原的紫外譜圖與提取液中膠原濃度的檢測(cè)方法

對(duì)膠原標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)驗(yàn)所得膠原溶液進(jìn)行全掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)的特征吸收峰在280nm左右，這主要是酪氨酸（278 nm）和苯丙氨酸（259 nm）對(duì)紫外的吸收疊加［9］。

圖1　兩種方法提取膠原的紫外譜圖

圖2 為膠原醋酸溶液濃度于280nm處紫外吸收的依賴性曲線，通過對(duì)不同濃度膠原溶液在280nm處吸光度的檢測(cè)，可以得到膠原濃度于280nm的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于檢測(cè)提取過程膠原濃度的變化。

圖2　膠原醋酸溶液濃度于280nm處紫外吸收的依賴性

2.3超聲波對(duì)于膠原提取的影響

酶法提取膠原和超聲波-酶法提取膠原過程中膠原濃度的變化趨勢(shì)見圖3。結(jié)果顯示，在這個(gè)提取過程中，超聲波-酶法提取得到的膠原溶液濃度始終高于傳統(tǒng)的酶提取法。兩種方法提取過程中膠原得率值如表2所示。膠原提取2d后，相比傳統(tǒng)的酶法，超聲波-酶提取法的膠原得率由24.93%提高到30.86%。這說明傳統(tǒng)的酶法提取膠原需要浪費(fèi)更多時(shí)間而得到較少產(chǎn)品，而超聲波-酶提取法可以加快天然膠原纖維水解從而得到膠原分子。另外，超聲波-酶法提取中膠原濃度在提取過程的前16h增加迅速，24h時(shí)濃度基本平衡，說明此方法的提取時(shí)間可由傳統(tǒng)方法的2d縮短到不足1d。顯然，提取時(shí)間的減少對(duì)節(jié)約能源和保持膠原活性都是好的。

圖3　提取液濃度隨時(shí)間的變化（λ=280nm）

表2　超聲波-酶法與胃蛋白酶法的膠原提取率

2.4單獨(dú)攪拌和超聲波對(duì)膠原提取率的影響

單獨(dú)攪拌和超聲波對(duì)膠原液濃度的變化趨勢(shì)如圖4所示。由圖4可知，沒有胃蛋白酶存在的情況下，超聲波提取只能得到很少的膠原，攪拌提取得到的膠原更少。結(jié)果說明超聲波可以打散膠原纖維，使更多的酸溶膠原溶出，但這個(gè)作用是有限的，16h后幾乎沒有酸溶膠原再溶出。

圖4　膠原濃度隨時(shí)間的變化曲線

2.5膠原的紅外譜圖與分析

膠原蛋白有4個(gè)特征吸收峰，為3330 cm-1、2930 cm-1、1636～1661 cm-1和1450～1230cm-1。由圖5可以看出，胃蛋白酶法與超聲波酶法提取得到的膠原蛋白都有這4個(gè)主要的吸收峰，3346cm-1、3329cm-1和2937cm-1、2935cm-1附近是N-H伸縮振動(dòng)，1645cm-1附近是酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動(dòng)，1394和1387cm-1是N-H伸縮振動(dòng)［10］，說明超聲波不會(huì)破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。

圖5　膠原蛋白的紅外譜圖

3　結(jié)論

多次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，用超聲波-酶法提取出來的膠原蛋白產(chǎn)率要比胃蛋白酶法的產(chǎn)率高，且提取時(shí)間短。紅外與紫外測(cè)試譜圖顯示，超聲波-酶法提取得到的膠原相比傳統(tǒng)酶法提取得到的膠原，其主要特征吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)吸收峰基本一致，均保留了其三股螺旋結(jié)構(gòu)。

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Extraction of Collagen from Bovine Tendon by Ultrasonic - Enzymatic Method

ZHANG Yun-feng
（Department of Chemistry and Chemical Engineering， Taiyuan Institute of Technology， Taiyuan 030008， China； ）

This study compared the collagen yield which extracted from bovine tendon by stomach protein enzymatic method and ultrasonic-enzymatic method. The collagen was teste d by infrared spectrum and ultraviolet spectrum. Experiments showed that the yield of ultrasonic-enzymatic method was signifi cantly higher than stomach protein enzymatic method.

ultrasound； extraction； infrared spectrum； ultraviolet spectrum

TQ 93

A

1671-9905（2015）12-0023-03

張?jiān)气P（1987-），女，碩士

2015-10-09