多肽誘導(dǎo)的巨型脂質(zhì)體出芽和泄露行為

孫建波 夏玉瓊 于秋紅 梁德海

（北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，北京 100871）

多肽誘導(dǎo)的巨型脂質(zhì)體出芽和泄露行為

孫建波 夏玉瓊 于秋紅 梁德海*

（北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，北京 100871）

細(xì)胞膜與膜蛋白之間的相互作用與生命中許多過程息息相關(guān). 以巨型脂質(zhì)體（GUV）和多肽分別作為細(xì)胞膜和膜蛋白的簡(jiǎn)化模型, 我們?cè)O(shè)計(jì)了四種僅包含亮氨酸（L）和賴氨酸（K）的多肽, 即K14、（KL2KL2K）2、（KL2KL3）2和K6L8, 并對(duì)比研究了它們與中性和負(fù)電性脂質(zhì)體的相互作用. 電荷密度最高的K14只是涂層在脂質(zhì)體表面, 不破其囊泡結(jié)構(gòu), 但能夠引起負(fù)電性脂質(zhì)體發(fā)生微相分離, 屬建設(shè)性相互作用. 能夠形成兩親性α螺旋的（KL2KL2K）2和（KL2KL3）2則引起脂質(zhì)體發(fā)生泄露和破裂, 屬破壞性作用. 但二者引起泄露的速率在中性脂質(zhì)體和負(fù)電性脂質(zhì)體中的結(jié)果恰好相反, 說明泄露分兩步進(jìn)行： 表面吸附多肽達(dá)到一定濃度, 繼而對(duì)膜進(jìn)行干擾. 表面活性劑型多肽K6L8的氨基酸組成與（KL2KL2K）2相同, 但K6L8只是引起負(fù)電性脂質(zhì)體發(fā)生泄露, 造成中性脂質(zhì)體發(fā)生外出芽. 這些簡(jiǎn)單氨基酸造成的脂質(zhì)體的復(fù)雜構(gòu)象變化可以統(tǒng)一用靜電和疏水相互作用在膜上的位置和強(qiáng)度來進(jìn)行解釋. 這些結(jié)論對(duì)于深入理解膜蛋白的作用機(jī)理是有幫助的.

多肽； 巨型脂質(zhì)體； 出芽； 泄露

1 引 言

在生理環(huán)境中，細(xì)胞膜無時(shí)無刻不在進(jìn)行著構(gòu)象變化，如融合、出芽和內(nèi)吞等. 這些構(gòu)象變化決定著細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂、神經(jīng)元軸細(xì)胞的延伸、囊泡運(yùn)輸?shù)壬锕δ?1細(xì)胞從外界環(huán)境攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及排除廢物也離不開構(gòu)象變化. 靶向藥物的開發(fā)和基因治療的首要問題就是要解決細(xì)胞的攝取問題，這與細(xì)胞膜的內(nèi)吞是密切相關(guān)的. 細(xì)胞膜的構(gòu)象變化在很大程度上是由膜蛋白來控制的. 例如，發(fā)動(dòng)蛋白會(huì)與肌醇頭基磷脂分子發(fā)生特異性結(jié)合而形成螺旋狀寡聚體，從而把膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)限制成管狀.2內(nèi)吞過程中涉及的網(wǎng)格蛋白、3COPI與COPII4則是通過自身聚集形成特定結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致膜進(jìn)行彎曲. 研究還發(fā)現(xiàn)，固有曲率為錐形的跨膜蛋白，如煙堿樣乙酰膽堿受體的跨膜結(jié)構(gòu)域5，6或具有電壓依賴性的K+通道蛋白，會(huì)傾向于插入到與其相匹配的曲率膜中，通過與附著蛋白發(fā)生進(jìn)一步聚集，從而改變細(xì)胞膜局部曲率.7

膜蛋白本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難溶于水，其功能一般只有和膜相互作用時(shí)才體現(xiàn)出來，這些都阻礙了人們對(duì)膜蛋白及其與膜作用機(jī)理的深入認(rèn)識(shí). 近年來發(fā)展起來的分而治之（divide and conquer）的策略8，9很好地緩解了這一困境. 分而治之的基本思想就是把蛋白分割成不同序列的多肽，分別進(jìn)行研究，然后把結(jié)果綜合起來，這使得問題大幅度簡(jiǎn)化. 在此基礎(chǔ)上人們開發(fā)并研究了抗菌肽、10跨膜肽、11穿膜肽12，13與融合肽等.14更進(jìn)一步，利用組成已知的脂質(zhì)體來代替細(xì)胞膜，15人們初步研究了這些多肽以及聚多肽16，17與脂質(zhì)體18的相互作用.19例如，融合肽能夠部分插入到脂質(zhì)體膜中，外露的部分能夠通過coil-coil作用20導(dǎo)致脂質(zhì)體發(fā)生融合，成功模擬了體內(nèi)snare蛋白的功能.13當(dāng)多肽的α螺旋程度降低時(shí)，它對(duì)脂質(zhì)體的破壞作用會(huì)顯著下降.21這些研究對(duì)于揭示細(xì)胞膜與蛋白作用的機(jī)理都是有幫助的.

但是到目前為止，人們對(duì)多肽和脂質(zhì)體膜的相互作用研究還處在初級(jí)階段，對(duì)于一些機(jī)理的認(rèn)識(shí)還存在爭(zhēng)議，例如穿膜肽的作用機(jī)理還不清楚，多肽序列和膜變形的關(guān)系還沒有建立起來. 盡管多肽與膜蛋白相比，缺少了三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，但是可調(diào)因素仍然很多，包括氨基酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、多肽的長(zhǎng)度、電荷密度和分布、疏水比例等. 這些因素都會(huì)對(duì)多肽與脂質(zhì)體膜的作用效果帶來影響.

多肽與脂質(zhì)體膜之間主要是靜電相互作用和疏水相互作用，可以僅選取帶電和疏水兩種氨基酸組成的多肽序列來進(jìn)行研究，這會(huì)使得問題更進(jìn)一步簡(jiǎn)化. 在本文中，我們利用正電的賴氨酸（K）和疏水的亮氨酸（L），自主設(shè)計(jì)了四種長(zhǎng)度為14個(gè)殘基的氨基酸序列（表1），對(duì)比研究了它們與中性和負(fù)電性巨型脂質(zhì)體（GUV）的相互作用，原位跟蹤動(dòng)力學(xué)，并初步評(píng)價(jià)多肽序列與膜變形的關(guān)系.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣 品

鈣黃綠素購(gòu)于Sigma Aldrich公司，純度＞ 99%.二棕櫚酰磷脂酰-N-磺化麗絲胺羅丹明的銨鹽（Rh-DPPE）、1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂酰膽堿（POPC）、1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂磷脂酰甘油 （POPG）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）的有機(jī)溶液購(gòu)于Avanti Polar Lipids公司，純度＞ 99%. 多肽Ac-KKKKKKLLLLLLLL-amide（K6L8），Ac-KLLKLLKKLLKLLK-amide （KL2KL2K）2，Ac-KLLKLLLKLLKLLL-amide （KL2KL3）2和Ac-KKKKKKKKKKKKKK-amide （K14） 購(gòu)自吉爾生化公司（上海，純度＞ 98%）. 實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q（Millipore）超純水（電阻率為18.2 MΩcm）.

表1 多肽序列Table 1 Peptide sequence

2.2 巨型脂質(zhì)體（GUV）的制備

巨型脂質(zhì)體采用電形成法，22在由兩層氧化銦錫（ITO）玻璃和厚度為2 mm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）構(gòu)成的腔室內(nèi)制備. 裝置的細(xì)節(jié)可參見Dimitrov和Angelova23的工作. ITO玻璃依次用甲醇溶液沖洗三次，甲醇/氯仿溶液超聲20 min，氯仿溶液超聲20 min，甲醇超聲20 min，純凈水超聲20 min，最后自然晾干. 利用95%氯仿/5%乙腈的混合溶劑配置濃度為3.75 mgmL-1的磷脂溶液. 在800 rmin-1、1 min的條件下將0.8 mL磷脂溶液旋涂在尺寸為50 mm × 50 mm × 1.1 mm的ITO玻璃上.24把ITO玻璃與PDMS組裝成腔室，25 °C預(yù)熱10 min后，往腔室中加入預(yù)熱過的0.1 molL-1蔗糖溶液進(jìn)行水化，期間施加2.0 V、10 Hz的正弦交流電壓. 4 h后，電壓調(diào)節(jié)為3.0 V、5 Hz，并持續(xù)1 h. 采用這種方法分別制備POPC和POPC/POPG 摩爾比為4 : 1的巨型脂質(zhì)體. 脂質(zhì)體中摻入了0.2%羅丹明B標(biāo)記的磷脂Rh-DPPE來進(jìn)行標(biāo)記.

2.3 巨型脂質(zhì)體與多肽相互作用實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中利用激光共聚焦顯微鏡（A1R-si，日本尼康公司）來跟蹤研究巨型脂質(zhì)體與多肽的相互作用過程. 在自制的直徑為9 mm的圓型孔槽內(nèi)加入200 μL 0.1 molL-1葡萄糖與50 μmolL-1鈣黃綠素的混合溶液（pH = 7），加入適量多肽溶液，25 °C預(yù)熱5 min. 之后加入10 μL巨型脂質(zhì)體溶液，最終多肽與脂質(zhì)分子摩爾比為1/80，并開始計(jì)時(shí). 因?yàn)檎崽堑拿芏缺绕咸烟谴?，巨型脂質(zhì)體會(huì)沉到圓型孔槽底部，25便于用激光共聚焦顯微鏡原位跟蹤觀察. 如果脂質(zhì)體發(fā)生泄露，環(huán)境中的鈣黃綠素就會(huì)進(jìn)入到脂質(zhì)體內(nèi)部. 跟蹤脂質(zhì)體內(nèi)部鈣黃綠素濃度的變化，可以得到泄露的動(dòng)力學(xué)曲線.

3 結(jié)果與討論

3.1 多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)

在水溶液中只有疏水比例較高的（KL2KL3）2形成α螺旋結(jié)構(gòu)，其它多肽均為無規(guī)結(jié)構(gòu). 而在疏水環(huán)境中除了K14為無規(guī)結(jié)構(gòu)以外，其余多肽均以α螺旋結(jié)構(gòu)（含量＞ 50%）為主.26圖1對(duì)比了四種多肽的三維（3D）螺旋輪示意圖. 其中K14也繪成了α螺旋結(jié)構(gòu)以方便對(duì)比. 從圖1可以清楚地看到帶電氨基酸和疏水氨基酸的比例和分布.

圖1 四種多肽序列3D螺旋輪的對(duì)比圖Fig.1 Comparison of 3D helical wheel diagram of the four peptides

3.2 K14與巨型脂質(zhì)體作用

在四種多肽中，K14全部由正電氨基酸殘基構(gòu)成，因此電荷密度最高. 它能夠和負(fù)電GUV發(fā)生靜電相互作用，和中性GUV 發(fā)生電荷-偶極相互作用. 如圖2所示，中性和負(fù)電性GUV在與K14作用時(shí)都保持了囊泡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在所研究的時(shí)間范圍內(nèi)沒有觀察到膜出現(xiàn)泄露或變形行為. 與中性GUV不同的是，負(fù)電性GUV的膜表面發(fā)生了微相分離，從3D重構(gòu)（圖2（C））圖中可以清晰地觀察到熒光分布的非均勻性. 微相分離主要是因?yàn)镵14與負(fù)電磷脂發(fā)生強(qiáng)的靜電吸引時(shí)，會(huì)引起負(fù)電磷脂的聚集和重新分布，從而產(chǎn)生負(fù)電磷脂富集區(qū)和貧瘠區(qū). 僅存在靜電相互作用時(shí)，脂質(zhì)體不會(huì)發(fā)生變形，與文獻(xiàn)27中的報(bào)道是一致的.

圖2 K14與POPC （A）和n（POPC）/n（POPG） = 4 : 1 （B）形成GUV的相互作用Fig.2 K14interacting with POPC （A） or n（POPC）/n（POPG） =4 : 1 GUV （B）

3.3 （KL2KL2K）2和（KL2KL3）2與巨型脂質(zhì)體作用

（KL2KL2K）2和（KL2KL3）2在疏水環(huán)境中都能夠形成兩親性α螺旋（圖1）. 二者的主要區(qū)別是帶電氨基酸和疏水氨基酸的數(shù)目比例不同，前者為6/8，而后者為4/10.

圖3對(duì)比了（KL2KL2K）2和（KL2KL3）2與中性GUV相互作用的結(jié)果. 在兩種情況下，環(huán)境中的鈣黃綠素都進(jìn)入到GUV內(nèi)部，表明發(fā)生了泄露. 在（KL2KL2K）2存在下，泄露是逐漸發(fā)生的，沒有觀察到誘導(dǎo)期的存在，且最終GUV發(fā)生破裂（圖3（A））； 而在（KL2KL3）2存在下，泄露存在誘導(dǎo)期，速度也很慢，但整體膜并沒有被破壞（圖3（B））. 圖3（C）對(duì)比了二者的動(dòng)力學(xué)曲線，利用指數(shù)增長(zhǎng)模型對(duì)曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示（KL2KL2K）2和（KL2KL3）2引起的特征泄露時(shí)間分別為145和178 s，說明疏水比例較低的多肽（KL2KL2K）2引起脂質(zhì)體的泄露的能力對(duì)疏水比例較高的（KL2KL3）2要強(qiáng).

而在負(fù)電性脂質(zhì)體中得到的結(jié)論卻恰好相反.如圖4（A）和4（B）所示，（KL2KL2K）2和（KL2KL3）2都首先在GUV的表面富集，表現(xiàn)為界面的模糊化，其實(shí)這是所有負(fù)電GUV與正電多肽作用的普遍現(xiàn)象. 隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩種脂質(zhì)體都引起GUV發(fā)生了泄露，并最終導(dǎo)致GUV發(fā)生破裂. 圖4（C）對(duì)比了二者的動(dòng)力學(xué)曲線，泄露發(fā)生前都存在誘導(dǎo)期，但（KL2KL3）2的誘導(dǎo)期明顯比（KL2KL2K）2要長(zhǎng)很多. 擬合結(jié)果顯示，（KL2KL2K）2和（KL2KL3）2引起泄露的時(shí)間分別為131和108 s，說明二者對(duì)膜的破壞能力存在一定差異.

圖3 中性GUV在（KL2KL2K）2（A） 和 （KL2KL3）2（B）存在下的泄露行為及其二者對(duì)鈣黃綠素的動(dòng)力學(xué)泄露曲線（C）的對(duì)比Fig.3 Leakage behavior of （KL2KL2K）2（A） and （KL2KL3）2（B） interacting with neutral GUV（POPC） and comparision of dynamic leakage curves of calcein for （KL2KL2K）2and （KL2KL3）2（C）

圖4 負(fù)電性GUV（n（POPC）/n（POPG） = 4 : 1）在（KL2KL2K）2（A）和（KL2KL3）2（B）存在下的泄露行為及其二者的鈣黃綠素動(dòng)力學(xué)泄露曲線的對(duì)比（C）Fig.4 （KL2KL2K）2（A） and （KL2KL3）2（B） interacting with anionic GUV （n（POPC）/n（POPG） = 4 : 1），and comparision of dynamic leakage curves of calcein for （KL2KL2K）2and （KL2KL3）2（C）

對(duì)比圖3和圖4不難發(fā)現(xiàn)，兩種多肽引起負(fù)電GUV的泄露程度都比中性GUV劇烈，說明靜電吸引作用對(duì)泄露也有一定的貢獻(xiàn). （KL2KL3）2和 （KL2KL2K）2在中性和負(fù)電性GUV中泄露動(dòng)力學(xué)的差異可以用多肽在GUV表面吸附和對(duì)膜造成破壞兩個(gè)步驟來進(jìn)行解釋. 造成吸附的驅(qū)動(dòng)力以靜電相互作用為主，而對(duì)膜破壞以疏水作用為主. 只有GUV表面的多肽達(dá)到一定程度，并能夠與磷脂分子的疏水尾鏈（即插入到膜中）發(fā)生作用時(shí)，泄露才會(huì)發(fā)生. 對(duì)于中性GUV，多肽的吸附為速控步，電荷比例較高的（KL2KL2K）2與GUV的吸附能力強(qiáng)，泄露速度快. 而對(duì)于負(fù)電性GUV，由于強(qiáng)的靜電作用，吸附作用都加強(qiáng). 但靜電和疏水作用位點(diǎn)不同，前者與膜表面的親水頭基作用，而后者則與膜內(nèi)部的疏水尾鏈作用，因此強(qiáng)的靜電吸引在一定程度上妨礙了多肽插入到膜的內(nèi)部. 這需要吸附更多的多肽分子來中和脂質(zhì)體表面的電荷，表現(xiàn)為脂質(zhì)體界面模糊（圖4（A，B）），誘導(dǎo)期增加. 靜電作用相對(duì)較弱的多肽（KL2KL3）2誘導(dǎo)期更長(zhǎng). 但一旦表面吸附的多肽達(dá)到臨界濃度，泄露會(huì)很快發(fā)生. 疏水力越強(qiáng)，作用越劇烈.

3.4 K6L8與巨型脂質(zhì)體作用

K6L8是表面活性劑型多肽，它與中性GUV發(fā)生作用時(shí)，引起了向外出芽. 如圖5所示，隨時(shí)間延長(zhǎng)，首先是脂質(zhì)體表面由于與K6L8之間的電荷-偶極作用發(fā)生聚集分相，GUV自身變長(zhǎng)，然后再?gòu)闹胁课恢米冋?，形成啞鈴型，啞鈴的非?duì)稱性增加，形成出芽. 三維重構(gòu)結(jié)果顯示，外出芽基本是球形，而主體則是橢圓形（圖5（B））. 利用激光共聚焦顯微鏡數(shù)據(jù)處理軟件可以統(tǒng)計(jì)GUV在出芽前（圖5（A）中（1））和形成啞鈴型結(jié)構(gòu)（圖5（A）中（3））的表面積與體積比（A/V）. 結(jié)果表明，A/V值從出芽前的0.25 μm-1增加到出芽后的0.30 μm-1，說明GUV的外層膜面積增加.28，29結(jié)合K6L8的疏水殘基分布，推斷向外出芽的機(jī)理如下: 多肽吸附到脂質(zhì)體表面后增加了吸附區(qū)域的線張力，導(dǎo)致線張力大于彎曲能，且同時(shí)多肽中疏水的L8嵌段插入到中性GUV膜中，但由于其長(zhǎng)度只有膜厚度的一半，因而造成巨型脂質(zhì)體外層膜面積增加，發(fā)生出芽.30，31

當(dāng)K6L8與負(fù)電GUV相互作用時(shí)，觀察到了快速破裂的過程（圖6）. 這是由于K6L8與負(fù)電GUV的靜電吸附能力太強(qiáng)，大量表面活性劑形成膠束狀結(jié)構(gòu)，對(duì)GUV的膜造成了溶解型破壞.

圖5 K6L8引起中性GUV （POPC）的向外出芽過程（A）與三維重構(gòu)圖（B）Fig.5 Outward budding process （A） and 3D reconstruction （B） for neutral GUV （POPC） caused by K6L8

圖6 K6L8體系中負(fù)電GUV （POPC/POPG）隨著時(shí)間的變化（A）及負(fù)電GUV內(nèi)部鈣黃綠素的填充比例動(dòng)力學(xué)（B）Fig.6 Kinetic process for negatively charged GUV（POPC/POPG） （A） with time and dynamic filling percentage of calcein （B） caused in K6L8system

4 結(jié) 論

僅有亮氨酸和賴氨酸構(gòu)成的多肽，由于序列和電荷比的不同，能夠引起脂質(zhì)體發(fā)生相變、泄露和出芽等過程. 以靜電相互作用為主的K14主要作用在GUV的表面，囊泡結(jié)構(gòu)保存了完整性. 利用這種吸附作用可以開發(fā)物理涂層多肽來改變脂質(zhì)體的性能，32因此這種作用可以認(rèn)為是建設(shè)性的. 兩親性多肽（KL2KL2K）2與（KL2KL3）2能夠引起脂質(zhì)體發(fā)生泄露和破裂，泄露的動(dòng)力學(xué)可以通過改變序列和疏水比進(jìn)行調(diào)控，這種破壞性作用有助于開發(fā)高效抗菌肽.而K6L8既具有破壞性作用，也能夠以吸附在表面和插入到膜內(nèi)的方式誘發(fā)出芽行為. 因此，這種構(gòu)象變化行為是建設(shè)性和破壞性作用競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果. 我們預(yù)測(cè)調(diào)控多肽在脂質(zhì)體表面的競(jìng)爭(zhēng)作用能夠引起更多的構(gòu)象變化行為. 考慮到K6L8和（KL2KL2K）2具有相同的氨基酸組成，只是序列分布不同，二者與脂質(zhì)體作用的差異可歸結(jié)為在膜中插入的深度和作用強(qiáng)度不同. 這些結(jié)論對(duì)于了解膜蛋白的作用機(jī)理是很有幫助的.

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Peptide-lnduced Budding and Leakage Behavior of Giant Vesicles

SUN Jian-Bo XIA Yu-Qiong YU Qiu-Hong LIANG De-Hai*
（Beijing National Laboratory for Molecular Sciences，College of Chemistry and Molecular Engineering，Peking University，Beijing 100871，P. R. China）

The interactions between membrane proteins and cell membranes are critical in many life processes. Giant unilamellar vesicles （GUVs） and peptides are simple but effective models of membranes and membrane proteins, respectively. Here, we designed four peptides composed of lysine （K） and leucine （L）amino acids, K14, （KL2KL2K）2, （KL2KL3）2, and K6L8, and examined their interactions with neutral and negatively charged GUVs. The peptide K14has the largest charge density and is able to coat the GUV surface without damaging its structure. Whereas, leakage is observed in both neutral and charged GUVs in the presence of（KL2KL2K）2and （KL2KL3）2, which can form amphiphilic α-helices in hydrophobic environments. However, the leakage rates as a function of peptide concentration are reversed for the neutral and charged GUVs. Thus, leakage occurs in two steps： absorption of peptides on the surface up to a certain level, followed by disruption of the membrane. The peptide K6L8has the same chemical composition as （KL2KL2K）2, but induces leakage only on negatively charged GUVs, while neutral GUVs undergo outward budding. Conformational changes of GUVs induced by simple peptides can be attributed to the working location （on the surface or inside the membrane）, and the strength of electrostatic and hydrophobic interactions. Overall, the results provide a better understanding of membrane protein mechanisms.

Peptide； Giant vesicle； Budding； Leakage

May 4，2015； Revised: August 25，2015； Published on Web: August 26，2015.

. Email: dliang@pku.edu.cn； Tel: +86-10-62756170.

O648

10.3866/PKU.WHXB201508262

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China （21074005，21174007）.國(guó)家自然科學(xué)基金（21074005，21174007）資助項(xiàng)目