一株費(fèi)氏丙酸桿菌生長(zhǎng)特性及其代謝物抑菌作用分析

鄭麗雪，王荊楚，時(shí)慧佳，曹 雪，齊 斌*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500；3.吉林中糧生化有限公司，玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130033）

一株費(fèi)氏丙酸桿菌生長(zhǎng)特性及其代謝物抑菌作用分析

鄭麗雪1，2，王荊楚2，時(shí)慧佳2，曹 雪3，齊 斌1，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500；3.吉林中糧生化有限公司，玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130033）

對(duì)一株費(fèi)氏丙酸桿菌 生長(zhǎng)特性及其代謝物抑菌作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該菌株生長(zhǎng)周期約為10 d，第1～3天為其對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期，第4～8天為菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，第9～10天為衰亡期。在生長(zhǎng)過(guò)程中，菌體利用糖的速率很快，還原糖在發(fā)酵1 d內(nèi)幾乎被消耗殆盡，發(fā)酵液pH值在發(fā)酵 的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩(wěn)定在4.6左右。在同等條件下，該 丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌的 抑制作用優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。對(duì)代謝產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)除了丙酸之外，還存在其他物質(zhì)，初步判定為細(xì)菌素。

丙酸桿菌；生長(zhǎng)特性；抑菌物質(zhì)；細(xì)菌素

近年來(lái)，關(guān)于丙酸桿菌代謝物的研究報(bào)道很多，賈彩鳳［1］、梁新樂(lè)［2］等做了丙酸桿菌代謝物作為食品防腐劑及在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用研究，Wang Peng［3］、梁澤鑫［4］等針對(duì)丙酸桿菌產(chǎn)酸特性進(jìn)行了研究，其他的研究工作主要集中在丙酸桿菌發(fā)酵代謝物抑菌作用的研究方面［5-12］。丙酸桿菌代謝產(chǎn)物中起到抑菌作用的主要物質(zhì)為細(xì)菌素。細(xì)菌素是由細(xì)菌代謝產(chǎn)生，對(duì)同種或近源種有特異性抑制殺菌作用的蛋白質(zhì)或多肽。由乳酸菌產(chǎn)生的多種細(xì)菌素已被分離并進(jìn)行了性質(zhì)分析［13-15］，其中Nisin已被多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)使用。丙酸桿菌細(xì)菌素是由丙酸桿菌合成的蛋白質(zhì)或多肽，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)的丙酸桿菌細(xì)菌素PLG-1［16］具有廣泛的抑菌作用，能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌、部分革蘭氏陽(yáng)性菌、霉菌和酵母［17］。法國(guó)羅地亞公司已經(jīng)把包含食品丙酸桿菌素的天然食品防腐劑開(kāi)發(fā)為產(chǎn)品，并在美國(guó)和歐洲市場(chǎng)大量銷(xiāo)售。國(guó)內(nèi)對(duì)于丙酸桿菌細(xì)菌素的研究還處于起步階段，本實(shí)驗(yàn)室也曾開(kāi)展過(guò)相關(guān)的研究工作，并取得一定成效［18-19］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株費(fèi)氏丙酸桿菌的生長(zhǎng)特性及其代 謝物的抑菌作用進(jìn)行研究，并對(duì)抑菌代謝產(chǎn)物性質(zhì)（是否為細(xì)菌素）進(jìn)行探討，以期為后續(xù)的分離、純化等方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種

費(fèi)氏丙酸桿菌、酵母菌2-10515 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存；金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；xs105du型電子天平、s20k型酸度計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；LHR-250型霉菌培養(yǎng)箱 上海索譜儀器有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；Milli-Q Advantage超純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1費(fèi)氏丙酸桿菌培養(yǎng)基

改良PYG培養(yǎng)基：酪蛋白胨5.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母提取物10.0 g、牛肉提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、K2HPO42.0 g、吐溫-80 1.0 mL、刃天青1.0 mL、鹽溶液40.0 mL，蒸餾水950.0 mL，氯化血紅素溶液10.0 mL，VK1溶液0.2 mL、L-半胱氨酸0.5 g，pH 7.2。鹽溶液：CaCl2·2H2O 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g，蒸餾水1.0 L。氯化血紅素溶液：氯化血紅素50.0 mg、1 mol/L NaOH 1.0 mL，蒸餾水99.0 mL。VK1溶液：VK10.1 mL，95%乙醇20.0 mL。

1.3.2大腸桿菌培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3.3金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3.4酵母菌培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基［20］。

1.4方法

1.4.1菌種活化

將斜面保存的費(fèi)氏丙酸桿菌菌株接種于改良的PYG固體培養(yǎng)基上，于30 ℃厭氧罐中厭氧培養(yǎng)2.5 d。

將斜面保存的金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。將斜面保存的酵母菌2-10515接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4.2生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將活化好的費(fèi)氏丙酸桿菌接種到改良PYG液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)10 d，每隔1 d吸取一定量的發(fā)酵液，以PYG液體培養(yǎng)基作為空白，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定發(fā)酵液光密度（OD）值，以此繪制費(fèi)氏丙酸桿菌生長(zhǎng)曲線。

1.4.3殘?zhí)呛康臏y(cè)定

每隔24 h吸取一定量的發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［10］測(cè)定上清液中殘?zhí)呛俊?/p>

1.4.4pH值測(cè)定

采用s20k型酸度計(jì)測(cè)定不同時(shí)間發(fā)酵液上清液pH值。

1.4.5費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物抑菌作用分析

1.4.5.1費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌抑制作用分析

將1 mL活化好的大腸桿菌菌液接入9 mL已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后向其中分別加入不同時(shí)間的費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液0.5 mL，混合液于36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，以一支9 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基+1 mL指示菌液+0.5 mL費(fèi)氏丙酸桿菌培養(yǎng)基管作為空白對(duì)照管，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合液OD值，考察不同時(shí)間的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌抑制作用。

1.4.5.2費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用分析

將1 mL活化好的金黃色葡萄球菌菌液接入9 mL已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，以下操作方法參照1.4.5.1節(jié)進(jìn)行。考察不同天數(shù)的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。

1.4.5.3費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)酵母菌抑制作用分析

將1 mL活化好的酵母菌菌液接入9 mL已滅菌的PDA培養(yǎng)基中，以下操作方法參照1.4.5.1節(jié)進(jìn)行?？疾觳煌鞌?shù)的發(fā)酵液對(duì)酵母菌的抑制作用。

1.4.6抑菌活性代謝產(chǎn)物分析

分別用1 mol/L丙酸和l mol/L乙酸調(diào)節(jié)費(fèi)氏丙酸桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH值至4.6（pH 4.6為費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液的終pH值），然后各取200 ?L調(diào)酸后的培養(yǎng)基加入含有指示菌（大腸桿菌）的平板牛津杯中，以費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液（8 d）為空白對(duì)照，36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，以此考察發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用是否因發(fā)酵產(chǎn)酸引起。

2　結(jié)果與分析

2.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，第1天菌體生長(zhǎng)速率很快，直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從第2～3天結(jié)束，菌體量增長(zhǎng)緩慢，從第4～8天結(jié)束，菌體量基本穩(wěn)定，第9天菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。

圖1　費(fèi)氏丙酸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Propionibacterium freudenreichii

2.2殘?zhí)呛繙y(cè)定結(jié)果

圖2　不同時(shí)間發(fā)酵液殘?zhí)呛縁ig.2 Amount of residual sugar at different fermentation times

由圖2可知，發(fā)酵液中的還原糖含量在發(fā)酵1 d內(nèi)幾乎被消耗殆盡（0.5%～0.1%），從第2～3天起，還原糖含量略有降低，之后基本不變。

2.3發(fā)酵液pH值

圖3　不同時(shí)間發(fā)酵液ppHH值Fig.3 pH at different fermentation times

如圖3所示，pH值在發(fā)酵的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩(wěn)定在4.6左右。這是由于丙酸桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生丙酸、乙酸等多種有機(jī)酸，pH值穩(wěn)定在4.6是有機(jī)酸產(chǎn)生和消耗相互平衡的結(jié)果［21］。發(fā)酵液中還原糖含量及pH值的變化趨勢(shì)和馬悅培等［22］研究的薛氏丙酸桿菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的還原糖含量及pH值變化趨勢(shì)相似。

2.4費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌抑制作用

如圖4所示，0 d為空白對(duì)照組，其他發(fā)酵時(shí)間的OD620nm值均小于空白對(duì)照組，這說(shuō)明費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌具有抑制作用。同時(shí)，每管發(fā)酵液代謝物對(duì)大腸桿菌的抑制作用相差不大（OD620nm值相近）。

2.5費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)金黃色葡萄球菌、酵母菌的抑制作用

圖5　不同時(shí)間費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)金黃色葡萄球菌（A）和酵母菌（B）抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of Propionibacterium freudenreichii metabolites at different fermentation times on Staphylococcus aureus （A） and yeast （B）

費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)金黃色葡萄球菌和酵母菌抑制作用分別如圖5A、5B所示，其中0 d為空白對(duì)照組，其他時(shí)間的OD620nm值均和空白對(duì)照組相差不大，綜合2.4節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這說(shuō)明在同等條件下，該費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。

2.6抑菌活性代謝產(chǎn)物分析結(jié)果

如圖6所示，經(jīng)丙酸調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)指示菌有抑制作用（圖中2所示，抑菌圈直徑為16 mm），但并沒(méi)有費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液的抑菌作用大（圖中1和3抑菌圈直徑平均值為24 mm），而經(jīng)乙酸調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì) 指示菌沒(méi)有抑制作用，這說(shuō)明：1）費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌有抑制作用；2）發(fā)酵產(chǎn)物乙酸沒(méi)有抑菌作用；3）發(fā)酵產(chǎn)物中的丙酸有抑菌作用；4）發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)除了丙酸之外，還存在其他物質(zhì)。盧楠等［5］對(duì)謝氏丙酸桿菌發(fā)酵廢液中生物抑菌物質(zhì)進(jìn)行了研究，她們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液可以抑制一些革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌及真菌，而且抑菌效果明顯優(yōu)于化學(xué)防腐劑，其主要抑菌成分為等電點(diǎn)在2.0附近的蛋白類(lèi)物質(zhì)、丙酸銨、乙酸銨。牛愛(ài)地等［23］對(duì)一株從酸菜中分離的有抑菌活性的乳桿菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，研究表明有抑菌活性的代謝產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)，且具有良好的熱穩(wěn)定性。這些蛋白類(lèi)的抑菌物質(zhì)就是細(xì)菌素。所以，本實(shí)驗(yàn)費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物中丙酸以外的抑菌物質(zhì)可初步判定為細(xì)菌素，在以后的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

圖6　費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物中抑菌物質(zhì)分析Fig.6 Antibacterial activity of Propionibacterium freudenreichii metabolites

3　結(jié) 論

通過(guò)對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌基本生長(zhǎng)特性的研究，得出該菌生長(zhǎng)周期約為10 d，第1～3天為其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4～8天為菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，第9～10天為衰亡期。在生長(zhǎng)過(guò)程中，菌體利用糖的速率很快，還原糖在發(fā)酵1 d內(nèi)幾乎被消耗殆盡，發(fā)酵液pH值在發(fā)酵的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩(wěn)定在4.6左右。通過(guò)對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物抑菌作用研究，得出在同等條件 下，費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌的抑制作用優(yōu)于對(duì)金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。對(duì)代謝產(chǎn)物分析結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)除了丙酸之外，還存在其他物質(zhì)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，初步推斷出這些物質(zhì)為細(xì)菌素，進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)開(kāi)展。

實(shí)驗(yàn)室小發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是在搖瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上開(kāi)展的，梁澤鑫等［4］研究了5 L罐產(chǎn)酸費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，取得了很好的效果。王曉云等［6］研究了補(bǔ)加氨水對(duì)薛氏丙酸桿菌分批發(fā)酵及代謝物抑菌活性的影響，研究表明，補(bǔ)加氨水后有效地調(diào)節(jié)了發(fā)酵液的pH值，顯著提高了費(fèi)氏丙酸桿菌代謝物的抑菌活性。Feng Xiaohai等［24］研究了7.5 L發(fā)酵罐中費(fèi)氏丙酸桿菌CCTCC M207015發(fā)酵產(chǎn)丙酸的動(dòng)力學(xué)。因此，高密度培養(yǎng)也將是本實(shí)驗(yàn)下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。另外，邱雯雯等［25］研究了直投式費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵劑的制備，利用制得的直投式發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶，酸奶指標(biāo)達(dá)到了指標(biāo)要求。所以，今后也可以考慮制備直投式的發(fā)酵劑用于食品發(fā)酵，取得發(fā)酵、防腐一舉兩得的效果。

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Growth Characteristics and Metabolite Bacteriostatic Action of Propionibacterium freudenreichii

ZHENG Lixue1，2， WANG Jingchu2， SHI Huijia2， CAO Xue3， QI Bin1，*
（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu 215500， China；2. Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology， Changshu 215500， China；3. National Engineering Research Center of Corn Deep Processing， Jilin CO FCO Bio-chemical Co. Ltd.， Changchun 130033， China）

The growth characteristics and metabolite bacteriostasis of Propionibacterium freudenreichii were studied. The results showed： the strain's growth cycl e was approximately 10 days， involving logarithmic phase （1-3 d）， stability phase（4-8 d） and decline phase （9-10 d）. In the process of growth， sugar was consumed quickly， and almost completely depleted in the first day. The pH after 1 day of fermentation dropped to 4.6 and then remained at 4.6 during the remaining fermentation period. Under the same conditions， the bacteriostatic effect of Propionibacterium fre udenreichii metabolites on E. coli was better than those of Staphylococcus aureus and yeast. Bacteriocins were dominant metabolites with antimicrobial activity besides propionic acid.

Propionibacterium freudenreichii； growth characteristics； antimicrobial substances； bacteriocins

Q939.9

A

1002-6630（2015）15-0163-04

10.7506/spkx1002-6630-201515030

2014-10-13

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2013339）；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201226；SYN201417）

鄭麗雪（1982—），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lixue9418@163.com

齊斌（1965—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程。E-mail：qibin65@126.com