昆蟲酚氧化酶功能及研究進(jìn)展

王俊秀，李亞紅

（山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西太原030006）

昆蟲酚氧化酶功能及研究進(jìn)展

王俊秀，李亞紅

（山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西太原030006）

酚氧化酶是昆蟲免疫系統(tǒng)一種重要的組成成分。本文就昆蟲酚氧化酶的研究進(jìn)行了總結(jié)與展望，供研究人員參考。

昆蟲；酚氧化酶；酚氧化酶原；激活

昆蟲酚氧化酶（phenoloxidase，PO）是一種含銅離子結(jié)合位點(diǎn)的氧化酶[1]，可催化2類反應(yīng)：一是催化單酚的加氧化作用，生成聯(lián)苯酚；二是催化聯(lián)苯酚的氧化作用，生成聯(lián)苯醌。在昆蟲體內(nèi)酚氧化酶可催化天然底物——酪氨酸的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生二羥基苯丙氨酸即多巴（dopa），多巴經(jīng)脫氨或脫羧形成多巴醌（dopaquinone）或多巴胺（dopamine），在一系列酶的作用下形成黑素（melanin）[2]。

1 昆蟲酚氧化酶的功能

昆蟲酚氧化酶在免疫應(yīng)答、異源物包囊過程中起關(guān)鍵作用。昆蟲存在2種不同類型的包囊作用：細(xì)胞型包囊（cellular encapsulation）和黑素型包囊（melanotic encapsulation）[3]。細(xì)胞型包囊主要發(fā)現(xiàn)于血細(xì)胞數(shù)目較多的昆蟲如鱗翅目中：首先由粒細(xì)胞（granular cells）和漿細(xì)胞（plasmatocytes）包裹外源物，形成一個(gè)由數(shù)層細(xì)胞組成的包囊，然后包囊內(nèi)部發(fā)生黑素化并殺死被包裹的入侵有機(jī)體[4]。黑素型包囊主要發(fā)現(xiàn)于血細(xì)胞數(shù)目較少的雙翅目昆蟲中,透明物質(zhì)（可能是活性酚氧化酶）和黏性蛋白首先包被外源物質(zhì)表面，然后酚氧化酶催化酪氨酸生成黑素，黑素再與包被物交聯(lián)形成膜鞘[5]。

當(dāng)昆蟲受傷時(shí)，創(chuàng)傷處會(huì)出現(xiàn)深色色素區(qū)，這是由于酚氧化酶在傷口處將酚氧化成醌，最終形成黑素所致。黑素可以將血淋巴凝結(jié)作用（coagula?tion）產(chǎn)生的凝膠類物質(zhì)進(jìn)一步硬化、黑化，堵塞傷口防止血淋巴流失，并阻止入侵的微生物乘機(jī)進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，由此對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用[6]。

酚氧化酶還參與昆蟲外骨骼的鞣化和骨化。該酶與乙酰化酶協(xié)同作用產(chǎn)生昆蟲表皮鞣化、骨化的關(guān)鍵物質(zhì)——N-乙酰多巴胺。N-乙酰多巴胺的芳香環(huán)和支鏈都可參與表皮蛋白質(zhì)交聯(lián)。鞣化是通過表皮蛋白質(zhì)的氮原子與芳香環(huán)活化位點(diǎn)共價(jià)連接；而骨化則利用N-乙酰多巴胺活化的支鏈同表皮蛋白質(zhì)連接[7]。

酚氧化酶是昆蟲應(yīng)對(duì)外源物入侵的免疫防御屏障，也是黑素合成、傷口愈合與外骨骼硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究酚氧化酶對(duì)于闡釋昆蟲免疫防御機(jī)制，理解蝗蟲體內(nèi)的免疫和生理、生化過程具有重要意義。

2 昆蟲酚氧化酶的激活

多數(shù)昆蟲酚氧化酶以無活性的酶原形式——酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO），存在于昆蟲血淋巴、中腸和表皮等組織。當(dāng)病原微生物入侵時(shí)，昆蟲免疫系統(tǒng)通過絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)途徑切除酚氧化酶原N-端50多個(gè)氨基酸，使其成為活化的酚氧化酶，參與機(jī)體的免疫防御反應(yīng)。具體激活途徑在幾種模式生物如果蠅、煙草天蛾和赤擬谷盜中相對(duì)清晰。下面以煙草天蛾酚氧化酶原激活途徑為例介紹，見圖1。首先革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)的肽聚糖或真菌的β-1,3-葡聚糖與β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白的復(fù)合物，可將血淋巴蛋白酶14前體激活為血淋巴蛋白酶14；接著血淋巴蛋白酶14又將血淋巴蛋白酶21前體剪切激活為血淋巴蛋白酶21；然后血淋巴蛋白酶21又將酚氧化酶原活化蛋白酶2和3的前體水解為酚氧化酶原活化蛋白酶2和3。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁與C-型凝集素和β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白結(jié)合后也可不經(jīng)血淋巴蛋白酶21而直接激活酚氧化酶原活化蛋白酶2和3前體；最終，酚氧化酶原活化蛋白酶2和3剪切酚氧化酶原得到活化的煙草天蛾酚氧化酶。

圖1 酚氧化酶原的激活模式圖[9]

3 昆蟲酚氧化酶的調(diào)控

酚氧化酶的催化產(chǎn)物——醌衍生物不僅殺死寄生蟲和病原菌，對(duì)自身細(xì)胞也有毒害作用。因此酚氧化酶原激活系統(tǒng)受到嚴(yán)格的調(diào)控。絲氨酸蛋白酶抑制劑-4可抑制血淋巴蛋白酶21活化，絲氨酸蛋白酶抑制劑-1J、-3和-6則抑制酚氧化酶原活化蛋白酶2和3的激活，它們最終都抑制酚氧化酶原的激活[9]。實(shí)際上無論是激活途徑還是抑制效應(yīng)都要?dú)w結(jié)為一點(diǎn)——酚氧化酶原N-端氨基酸的剪切調(diào)控。目前，不完全變態(tài)昆蟲酚氧化酶原絲氨酸水解級(jí)聯(lián)活化機(jī)制還不明了，蛋白酶剪切位點(diǎn)也無報(bào)道。昆蟲酚氧化酶在黑素合成、體壁硬化和免疫應(yīng)答反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，而酚氧化酶正常行使功能必須經(jīng)過酶原激活步驟，但不完全變態(tài)昆蟲相關(guān)機(jī)制研究幾乎還是空白，從分子水平開展不完全變態(tài)昆蟲酚氧化酶的激活機(jī)制研究對(duì)于理解酚氧化酶原如何行使功能具有重要的理論意義。

4 昆蟲酚氧化酶的研究現(xiàn)狀

早期的昆蟲酚氧化酶研究?jī)H限于初步的酶活測(cè)定和基本理化性質(zhì)研究。通常采用硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析、分子排阻層析等方法純化酚氧化酶原，再經(jīng)胰蛋白酶或變性劑處理，得到活化的酚氧化酶[8]。1999年，Lee等從大黃粉蟲（Tene?brio molitor）克隆得到了第一個(gè)昆蟲酚氧化酶原基因[9]。翌年，Hatta等也報(bào)道了黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）酚氧化酶原基因。隨后該酶的分子生物學(xué)研究得到長(zhǎng)足發(fā)展，至今已有15種昆蟲的酚氧化酶原基因被相繼克隆。多數(shù)昆蟲含有2類酚氧化酶原基因，即酚氧化酶原1（prophenoloxidase 1，PPO1）和 酚 氧 化 酶 原 2（prophenoloxidase 2，PPO2）。但也有例外如：岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）有6個(gè)酚氧化酶原基因，而瘤姬蜂（Pimpla hypochondria）有3個(gè)。組織特異性表達(dá)方面，酚氧化酶原基因在岡比亞按蚊的頭、胸、腹和馬氏管[10]；成年雌性斯氏按蚊（Anopheles stephensi）的脂肪體和體壁[11]，棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的體壁、血細(xì)胞和中腸均有明顯表達(dá)[12]，但騷擾阿蚊（Armiger?es subalbatus）只能在血細(xì)胞中檢測(cè)到酚氧化酶原基因，而在脂肪體、中腸和卵巢中均未檢測(cè)到[13]。這表明不同物種間酚氧化酶原基因的組織表達(dá)存在差異。

目前，昆蟲酚氧化酶研究還主要集中在完全變態(tài)昆蟲；而不完全變態(tài)昆蟲的相關(guān)研究較少，且大多停留在注射病原或寄生蟲后、觀察酚氧化酶活性變化，缺少分子水平的證據(jù)。蝗蟲僅3條基因序列報(bào)道：王世貴等從紅褐斑腿蝗（Diabolocatantops pin?guis）獲得1條 2 445 bp的酚氧化酶原2（PPO2）的cDNA序列；從飛蝗中獲得2條2 143 bp和2 471 bp的酚氧化酶原（PPO1和PPO2）的cDNA序列。還沒有關(guān)于這3個(gè)基因在mRNA及蛋白水平，不同部位和齡期間差異表達(dá)的報(bào)道。Anas等經(jīng)凝膠層析、離子交換層析、親和層析3步從飛蝗血淋巴中得到分子量為250 kDa的酚氧化酶原，并推測(cè)它是由81 kDa亞基組成的三聚體[14]；也有報(bào)道指出亞洲飛蝗酚氧化酶原是由78 kDa亞基組成的同源二聚體[15]。遺憾的是文獻(xiàn)并沒有提供酚氧化酶原的氨基酸序列信息，因此還不清楚它們是由PPO1還是PPO2組成的。2009年Li等成功解析了煙草天蛾酚氧化酶原的晶體結(jié)構(gòu)，這是首例3-型銅蛋白家族酚氧化酶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)[16]。它的公布為酚氧化酶的結(jié)構(gòu)研究指明了方向。文章指出煙草天蛾酚氧化酶原為異源二聚體，含有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的3-型雙銅活性中心，每個(gè)銅離子由3個(gè)保守的組氨酸結(jié)合，N-端51位精氨酸殘基為蛋白酶切位點(diǎn)，并推測(cè)該酶原的N-端電荷和酶結(jié)構(gòu)變化在激活過程中起關(guān)鍵作用。

5 總結(jié)

不完全變態(tài)昆蟲是昆蟲綱的重要成員，但不完全變態(tài)昆蟲酚氧化酶原的研究還較為薄弱。根據(jù)果蠅、岡比亞按蚊、赤擬谷盜等完全變態(tài)昆蟲的酚氧化酶的生理功能與調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步深入研究不完全變態(tài)昆蟲的酚氧化酶原的激活與調(diào)控規(guī)律，對(duì)于人類更加全面的了解昆蟲免疫系統(tǒng)的生理功能及調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

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〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

The Progress in the Research of Insect Phenoloxidase

WANG Jun-xiu,LI Ya-hong
(Institute of Applied Biology,Shanxi University,Shanxi Taiyuan,030006)

Phenoloxidase is an important component of insect immunity system.By using literature,this manuscript summarized the current status of the research on the insect phenoloxidase.

insect;phenoloxidase;prophenoloxidase;active

Q966

A

1674-0874(2015)03-0034-03

2015-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目[31101463]

王俊秀(1990-)，女，山西孝義人，在讀碩士，研究方向：昆蟲分子生物學(xué)。