抗腫瘤中藥金仙膠囊提取工藝研究

趙 英,楊 軍,盧永昌，廖志明，張愛軍*

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧810007；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041）

抗腫瘤中藥金仙膠囊提取工藝研究

趙 英1,楊 軍2,盧永昌1，廖志明1，張愛軍2*

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧810007；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041）

目的探討金仙膠囊的最佳提取工藝。方法利用正交實驗的方法，考察溶劑濃度、溶劑量、提取時間、提取次數(shù)對抗腫瘤中藥金仙膠囊中人參皂苷Rb1提取效果的影響。結(jié)果抗腫瘤中藥金仙膠囊中人參皂苷Rb1提取最掛工藝為：取處方藥材，8倍于藥材量的70%乙醇，提取3次，每次1.5 h。結(jié)論用該最佳工藝，最終人參皂苷Rb1提取轉(zhuǎn)移率平均可達(dá)到90.64%。

工藝研究；正交試驗；人參皂苷Rb1

我國由于人口的逐漸老齡化，以及吸煙、感染、污染和不良飲食習(xí)慣等問題的存在，腫瘤發(fā)生率呈明顯上升趨勢[1]。腫瘤由于發(fā)現(xiàn)時多屬中、晚期，手術(shù)治療效果差，放化療又都有明顯不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者生存質(zhì)量差，生存期短。而以中醫(yī)藥為主的綜合治療對控制患者病情發(fā)展，改善生活質(zhì)量，延長生存期有著重要意義，中醫(yī)藥復(fù)方在抗癌中達(dá)到近乎和放化療相當(dāng)療效的同時可以增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，減少人體損害?；仡櫧陙砜拱┓絼┑膶嶒炑芯?，總結(jié)經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)問題，對進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)療效可靠、毒副作用小的抗癌新藥頗有必要[2]。金仙膠囊來源于四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤?？频呐R床經(jīng)驗方。其主要功能主治為消癥解毒，益氣活血，化瘀止痛；臨床用于肺癌、肝癌、胃癌及其他消化道腫瘤證屬血瘀者[3]。人參皂苷 Rb1是人參二醇系皂苷，屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷類化合物，對于主要活性成分Rb1的研究，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及抗腫瘤、抗肝臟熱缺血再灌注等方面的研究非常廣泛[4]。為提高有效成分提取工藝的科學(xué)性，以人參皂苷Rb1含量為指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)選，為生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜分析儀，十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（北京科益恒達(dá)科技有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；DZF-6050AB型真空干燥箱(鄭州博科儀器設(shè)備有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)。

西洋參（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號：120524)；西洋參對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120997-200608）；人參皂苷Rb1(中國食品藥品檢定研究所，批號：110704-201122)。乙腈(色譜級，CAS 75-05-8)；石油醚(60～90℃)，正丁醇,磷酸,甲醇,乙醇等；均為分析純。

2 提取工藝的研究

經(jīng)藥效學(xué)對比實驗，處方的乙醇提取物效果較好，故選擇乙醇為提取溶劑，并進(jìn)行提取工藝的相關(guān)研究。采用處方藥材西洋參中含量較高的人參皂苷Rb1為含量測定指標(biāo)，進(jìn)行工藝的考察。

2.1 乙醇濃度對人參皂苷Rb1提取的影響

稱取西洋參等藥材共62.5 g，加入8倍量的40%的乙醇，200目篩過濾，冷至室溫，每次1 h，共3次，合并濾液，量定體積，取濾液定容至10 mL作為供試品，采用HPLC方法測定有效成分人參皂苷Rb1的含量，剩余濾液減壓回收干燥。50%，60%，70%，80%的乙醇提取操作同40%乙醇的提取方法。用40%，50%，60%，70%，80%濃度的乙醇提取提取物量分別為8.65，8.71，9.01，8.53，6.24 g。

從上述實驗結(jié)果可以看出,隨著乙醇濃度的增加,人參皂苷Rb1含量也逐漸增加,但當(dāng)乙醇濃度超過70%以后,人參皂苷Rb1含量隨乙醇濃度的增加反而減少。因此,選擇甲醇濃度70%為最佳濃度。

2.2 正交實驗

以處方藥材西洋參中人參皂苷Rb1的含量為考察指標(biāo)，在考察單因素影響的預(yù)試驗基礎(chǔ)上,選擇70%乙醇作為提取溶劑，以主藥效物質(zhì)人參皂苷Rb1的提取總量為考察因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行實驗[5-6]，確定最佳工藝。正交實驗因素和水平設(shè)置見表1。

表1 正交試驗因素水平表

取藥材處方量62.5 g，并根據(jù)正交實驗表格進(jìn)行試驗，每個水平都合并提取液并且最終定容至10 mL，其余提取液都濃縮成提取物。進(jìn)樣量均為10 μL，實驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果直觀分析表

根據(jù)實驗結(jié)果，進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 正交試驗方差分析表[7]

由直觀分析可知，影響因素主次為：提取次數(shù)(C)＞乙醇濃度(B)＞提取時間(A)＞加醇量(D)。從方差分析可知，提取次數(shù)(C)與乙醇濃度(B)具有顯著性，提取時間(A)與加醇量(D)對人參皂苷Rb1提取沒有太大的影響，最終選擇A2B3C3D2為最佳工藝，即為使用70%的乙醇為溶劑，加8倍于藥材量的乙醇，提取3次，每次提取1.5 h。

2.3 驗證試驗[8]

為進(jìn)一步考察優(yōu)化工藝的可靠性，取3份藥材，每份62.5 g，按上述最佳提取工藝A2B3C3進(jìn)行驗證試驗，操作方法同上，最終得出人參皂苷Rb1平均總量分別127.0，128.8，127.9 mg，表明在最優(yōu)條件下人參皂苷Rb1含量高于其他各正交實驗值，其RSD為0.59%，說明該方法穩(wěn)定、可行。

2.4 放大實驗

根據(jù)篩選的最佳工藝進(jìn)行放大實驗，取處方藥材共計312.5 g（即5倍的處方量），按加8倍于藥材量的乙醇，提取3次，每次提取1.5 h的工藝路線進(jìn)行放大實驗。

根據(jù)實驗結(jié)果表明人參皂苷Rb1總量為639.80，634.29，642.96 mg，轉(zhuǎn)移率為 90.75%、89.97%、91.20%與正交試驗結(jié)果相符合，從而可得知此工藝具有重復(fù)性和穩(wěn)定性。即為20140606批供試品。

3 含量測定方法學(xué)考察

3.1 色譜條件[9]

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1%磷酸溶液流動相A；以乙腈流動相B，按下表4中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為203 nm；柱溫40℃。

表4 梯度洗脫表

3.2 溶液制備

3.2.1 對照品溶液制備

取人參皂苷Rb110.03 mg，加甲醇制得每1 mL含人身皂苷Rb11 mg的溶液。

3.2.2 供試品溶液制備

取20130606批供試品1.498 g，置于圓底燒瓶中，加入水飽和正丁醇50 mL，稱定質(zhì)量，置水浴中加熱回流提取1.5 h，放冷，搖勻，濾過。轉(zhuǎn)移續(xù)濾液至蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加50%的甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 陰性供試品溶液制備

缺西洋參藥材，按最終確定的最優(yōu)工藝同法制得陰性供試品溶液。

3.3 測定方法考察

吸取供試品溶液、陰性供試品溶液、人參皂苷Rb1對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果見圖1。

圖1 樣品含量測定方法學(xué)考察圖譜

結(jié)論：由圖譜中可見，陰性供試品對人參皂苷的測定基本無干擾。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液0.5，1，3，5，7 μL，按上述色譜條件測定峰面積，測定數(shù)據(jù)得回歸方程：Y=204.61X+0.029 5，R=0.999 9，表明人參皂苷Rb1在0.479 7～7.026 7 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測定峰面積并用回歸方程測得各組分含量，結(jié)果表明RSD為0.17%小于2.0%，證明此條件下精密度高。

3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液，每隔6 h進(jìn)樣，進(jìn)樣3次，每次10 μL，用回歸方程測得各組分含量，結(jié)果表明RSD為0.35%小于2.0%，表明供試品溶液在0～12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 重復(fù)性實驗

取20140303批樣品5份，按上述條件制備并測定求算人參皂苷Rb1含量，用回歸方程測得各組分含量，結(jié)果表明RSD 0.45%小于2.0%，證明此條件下重復(fù)性好。

3.8 加樣回收實驗

取20140606批供試品（已測定人參皂苷Rb1含量為 14.168 4 mg∕mL）6份，各約0.062 5 g，分別置于100 mL的圓底燒瓶中，分成3組，每組2份，3組添加人參皂苷Rb1對照品溶液量分別為樣品中含量的80%，100%，120%（配置人參皂苷Rb1濃度為0.890 1 mg∕mL的對照品）。3組實驗最終測定的回收率為97.45%～98.83%，結(jié)果表明RSD=0.47%，小于2.0%，證明此條件具有良好的回收率。

4 結(jié)論與討論

提取、純化工藝：取處方藥材，加8倍于藥材量的70%乙醇，提取3次，每次1.5 h，濾液用200目篩網(wǎng)過濾，最終合并濾液，抽濾，減壓回收乙醇至適量，水浴濃縮至適量，減壓干燥得干提取物即得。

實驗中，線性、精密度實驗對實驗儀器的考察都符合正常范圍，準(zhǔn)確度，重復(fù)性，加樣回收實驗，不僅對儀器，同時也對操作者之間的誤差等系統(tǒng)誤差及偶然誤差都有所考察，都在誤差范圍內(nèi)。方法學(xué)考察符合標(biāo)準(zhǔn)，成為建立實驗方法的可靠依據(jù)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007)年修訂版[J].中華結(jié)核和呼吸，2007，30(1)：8-17.

[2]王星，王三虎，郭華.中藥復(fù)方抗癌實驗研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2005，11(6)：71-73.

[3]張莉，唐大軒，譚正懷.金仙膠囊不同提取工藝的急性毒性及其抗腫瘤作用研究[J].四川中醫(yī)，2014，32(2)：67-69.

[4]楊秋婭，李曉宇，劉皋林.人參皂苷Rb1的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2013，40(15)：1233-1237.

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[9]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典(2010版一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

Study on Extraction Process of Anti-tumor Medicine Jinxian Capsule

ZHAO Ying1,YANG Jun2,LU Yong-chang1,LIAO Zhi-ming1,ZHANG Ai-jun2*
（1.College of Pharmacy,Qinghai University for Nationalities,Xining Qinghai,810007；2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences,Chengdu Sichuan,610041)

ObjectiveTo explore best extraction process of Jinxian capsule.MethodTo study the influence of solvent strength,sol?vent quantity,extraction time and times of extraction on ginseng saponin Rb1in anti-tumor medicine Jinxian capsule.ResultThe best extraction process of ginseng saponin Rb1in anti-tumor medicine Jinxian capsule:prescription materials,8 times of 70%ethanol,ex?tract three times,each time lasting 1.5 h.ConclusionThe extraction rate of ginseng saponin Rb1can reach 90.64%through this extrac?tion process.

technology research;orthogonal test;ginseng saponin Rb1

R94

A

1674-0874(2015)05-0055-04

2015-08-13

趙英（1993-），女，山西運(yùn)城人，碩士，研究方向：藥物分析專業(yè)。*張愛軍，研究員，通信作者。

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕