青蛤（Cyclina sinensis）親環(huán)素A基因的克隆與鰻弧菌刺激后的表達(dá)分析

張海靜，魏 星，潘寶平

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

青蛤（Cyclina sinensis）是我國(guó)沿海常見的經(jīng)濟(jì)貝類.由于其具有生長(zhǎng)迅速、肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高和對(duì)環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性等產(chǎn)業(yè)化增養(yǎng)殖特點(diǎn)，目前我國(guó)對(duì)于青蛤的增養(yǎng)殖區(qū)域相當(dāng)廣泛[1]，隨之而來(lái)有關(guān)青蛤大規(guī)模病害和死亡現(xiàn)象的報(bào)道也日益增多.因此為推動(dòng)國(guó)內(nèi)青蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，開展對(duì)青蛤免疫抗病害機(jī)制方面的研究顯得尤為重要.

親環(huán)素（Cyplophilin）是一個(gè)多功能蛋白家族，也是一種普遍分布的胞內(nèi)蛋白，具有肽基脯氨基順反異構(gòu)酶（PPIase）活性[2]，能夠加速自身折疊、體內(nèi)新生肽鏈折疊及變性蛋白質(zhì)的體外折疊，起到分子伴侶的作用[3].親環(huán)素A具有多種生物學(xué)活性，可參與信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等.在細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動(dòng)物中分布廣泛，同時(shí)在生物進(jìn)化過程中具有很高的保守性[4].據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，至少在六億年以前就存在親環(huán)素，在長(zhǎng)期的演變和進(jìn)化過程中，它始終存在于各種生物的細(xì)胞內(nèi)，擔(dān)當(dāng)著管家基因（Housekeeping genes）產(chǎn)物的角色[5].親環(huán)素A（Cyplophilin A，CypA）是親環(huán)素家族內(nèi)存在最廣泛、保守性最強(qiáng)的一類，是環(huán)孢素A的細(xì)胞內(nèi)受體，介導(dǎo)環(huán)孢素A發(fā)揮免疫抑制作用[6].它在細(xì)胞和體液中的含量直接影響環(huán)孢素A的藥效發(fā)揮.親環(huán)素A最早被發(fā)現(xiàn)存在于牛胸腺細(xì)胞中，并被提取出來(lái)[7]，之后從多種動(dòng)植物的細(xì)胞中也提取出該種蛋白，并克隆出了異構(gòu)體，這些異構(gòu)體構(gòu)成了親環(huán)素A的蛋白家族[8].按照蛋白來(lái)源，可將親環(huán)素A家族大致分為線蟲類、眼蟲類、真菌類、扁形類、植物類和哺乳動(dòng)物類6大類，其中研究最詳盡的是人體和擬南芥中的親環(huán)素[9]，對(duì)于軟體動(dòng)物中親環(huán)素的報(bào)道相對(duì)較少.

本研究從分子免疫學(xué)角度出發(fā)，對(duì)篩選出的青蛤親環(huán)素A基因（CypA）進(jìn)行一系列的基因及蛋白序列分析，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法研究青蛤體內(nèi)不同組織之間親環(huán)素A基因表達(dá)量的差異，觀測(cè)低濃度致病菌鰻弧菌侵染后不同時(shí)間內(nèi)青蛤血淋巴中親環(huán)素A表達(dá)量的變化，探討親環(huán)素A參與青蛤的固有免疫機(jī)制，為選育抗病能力較強(qiáng)的青蛤品系提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

活體青蛤樣品采于天津大港灘涂，選取形態(tài)指標(biāo)無(wú)顯著差異的個(gè)體，實(shí)驗(yàn)之前將青蛤放置在通氣的人工海水中暫養(yǎng)1～2周.持續(xù)曝氣，每24h換水1次，每天投喂0.005 g/mL的小球藻.

鰻弧菌為天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存菌種，實(shí)驗(yàn)之前將其以1∶100比例接種至2216E液體培養(yǎng)基中，放置于28℃搖床中200 r/min培養(yǎng)1 d.用隨機(jī)分組的方法，設(shè)10個(gè)平行組.實(shí)驗(yàn)組青蛤每只注射50μL鰻弧菌菌液，對(duì)照組青蛤每只注射等量滅菌生理鹽水.處理后用5 mL的注射器分別于 3、6、12、24、36、48h 時(shí)從閉殼肌取血.

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

將青蛤各組織放于液氮中研磨后，置于1 mL的trizol中提取組織總RNA，mRNA的分離按QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行.根據(jù)Clontech公司的SMART-cDNA Library Construction Kit試劑盒說明書進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，連接載體使用pBluescriptⅡSK+改造體，轉(zhuǎn)化菌株為 E.coli（DH5α）.文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序引物：T7-F（5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′），T3-R （5′-AATTAACCCTCACTAAAGG-3′）.所得序列去除載體序列后拼接得到contig和無(wú)法與其他序列拼接的singlest數(shù)據(jù)，將測(cè)得的序列用Blast進(jìn)行同源性分析.

1.2.2 鰻弧菌刺激后青蛤CypA基因在血淋巴內(nèi)的時(shí)序性表達(dá)

用鰻弧菌刺激青蛤后，測(cè)定青蛤CypA基因在血淋巴內(nèi)的時(shí)序性表達(dá).參照1.2.1中的方法，分別提取鰻弧菌刺激下各時(shí)間點(diǎn)的血淋巴總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA.以β-actin為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)定量引物為：βactin-F（5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′）；β-actin-R（5′-CCGATAGTGATGACCTGACC-3′）；CPL-F（5′-GTCACATTCGCCAAGCAA-3′）；CPL-R（5′-TGAAGGACCAGCAAGAGCC-3′）.反應(yīng)在iQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行，操作按照TAKARA公司的SYBRPremix DimerEraserTM（Perfect Real Time）使用說明進(jìn)行.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，最后72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán).數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法，使用SPSS軟件對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和空白組的表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析.

1.2.3 青蛤CypA基因的原核表達(dá)

用特異性引物CypA-F（5′-GGATCCATGGCTAACCCAAAGTGTTATTTTG-3′）和 CypA-R（5′TTCGAATTAAAGCTGACCACAATCTTGAATG-3′）擴(kuò)增得到青蛤CypA成熟肽基因，連接到pMD18-T載體中得到pMD18-T-CypA，并用 pMD18-T載體通用引物和青蛤CypA特異性引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，測(cè)序鑒定.用NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切pMD18-T-CypA，用試劑盒回收青蛤CypA基因并將其與NdeⅠ和EcoRⅠ酶切開環(huán)的pET30（+）連接，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組質(zhì)粒pET30（+）-CypA.用T7引物和CsCypA特異性引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選及測(cè)序鑒定.

1.2.4 重組蛋白的純化與復(fù)性

將轉(zhuǎn)化菌株接入到LB液體培養(yǎng)基中（含100 g/mL的硫酸卡那霉素），37℃、220 r/min培養(yǎng)至 OD值為600左右，取1 mL作為誘導(dǎo)前的對(duì)照，把IPTG（終質(zhì)量濃度1 mg/mL）加入到剩余的菌液中，37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔1h取樣1次，每次取1 mL.取500 mL誘導(dǎo)的菌液，4℃、6 000 r/min離心，收集菌體，以菌體裂解液重懸并超聲破碎.4℃、6 000 r/min再次離心，將沉淀重懸并過濾膜后得到重組蛋白粗提液.

重組蛋白粗提液使用康為世紀(jì)公司的Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）進(jìn)行純化，將收集到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè).采用透析法進(jìn)行復(fù)性，將純化后的蛋白放在透析袋中，內(nèi)含50 mmol/L 的 Tris-HCl和 6、4、3、2、1、0 mol/L 的尿素緩沖液（pH 5.5）.將復(fù)性后的蛋白凍干并稱重，置于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?

2 結(jié)果

2.1 青蛤CypA基因的結(jié)構(gòu)分析

構(gòu)建的容量為1.12×106cfu/mL的SMART-cDNA文庫(kù)，其重組率約為96.4%.經(jīng)隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序后，使用Blastx在線對(duì)其比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CypA家族基因的類似序列，并將此序列命名為青蛤CypA，在Gen Bank的注冊(cè)號(hào)為JN806098.

青蛤親環(huán)素A基因cDNA的核苷酸及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如圖1所示.

圖1 青蛤CypA全長(zhǎng)cDNA序列的開放閱讀框及功能域Fig.1 Open reading frame and functional domain of cDNA sequence of C.sinensis CypA

該 cDNA 序列全長(zhǎng)為 962 bp，5′UTR 為 87 bp，3′UTR為346 bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為495 bp，可以編碼164個(gè)氨基酸.使用SMART在線分析軟件對(duì)青蛤親環(huán)素A進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，由此證明親環(huán)素A屬胞內(nèi)蛋白，含有1個(gè)完整的Pro_isomeraes結(jié)構(gòu)域，為親環(huán)素A的典型結(jié)構(gòu)域.使用Prot-Param工具分析青蛤親環(huán)素A的理論相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸組成，其理論相對(duì)分子質(zhì)量為19.39 kDa（1 kDa=1 000摩爾質(zhì)量），理論等電點(diǎn)為5.25.成熟肽包含164個(gè)氨基酸，分子式為C1500H2507N495O637S85，氨基酸組成中丙氨酸（Ala）含量最大，占28.9%.使用Swiss-model和Swiss-PdbViewer在線分析軟件對(duì)獲得的青蛤親環(huán)素A的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和查看，結(jié)果顯示親環(huán)素A主要具有 α-螺旋（α-helix）、β 折疊（βsheet）和無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)，整體結(jié)構(gòu)比較緊湊.

2.2 鰻弧菌刺激后青蛤CypA基因在血淋巴內(nèi)的時(shí)序性變化

青蛤被鰻弧菌侵染后，以β-actin為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析青蛤CypA基因在血淋巴中表達(dá)量的時(shí)序變化，結(jié)果如圖2所示.

圖2 青蛤血細(xì)胞CypA基因在鰻弧菌刺激不同時(shí)間表達(dá)量的變化Fig.2 Relativeexpression of CypA gene in blood of C.sinensis infected by Vibrio anguillarum at different time

由圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)組在感染后3h時(shí)表達(dá)量開始升高并且達(dá)到最大值，與對(duì)照組的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01），6h后表達(dá)量大幅下降，96h時(shí)基因表達(dá)量恢復(fù)到正常水平.而對(duì)照組除了在6h時(shí)有略微升高之外，其余的時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化.

2.3 青蛤CypA基因的原核表達(dá)結(jié)果

對(duì)青蛤CypA成熟肽基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物長(zhǎng)度約為500 bp的DNA片段，與預(yù)期大小基本一致.pET-30和PMD18T-CypA經(jīng)雙酶切后，將所得目的片段和線性表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用試劑盒切膠回收，其目的片段大小為500 bp，與預(yù)期符合.具體結(jié)果如圖3所示.將所得CsCypA目的片段和pET-30線性質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行陽(yáng)性單克隆PCR檢測(cè)并送測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)正確，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖3 瓊脂糖凝膠電泳顯示的重組序列的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of recombination sequenceof CsCypA showed by AGE

2.4 重組蛋白的純化與復(fù)性結(jié)果

將構(gòu)建的重組i型溶菌酶基因工程菌（pcr-pET-30-CypA）提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)到大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中，擴(kuò)大培養(yǎng)后加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳離子交換柱分離并純化出重組蛋白.經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示，IPTG誘導(dǎo)后的菌體與誘導(dǎo)前對(duì)照樣品相比，該工程菌株誘導(dǎo)后的樣品在約19 kDa處產(chǎn)生了1條明顯的特異性電泳帶，并純化出了相應(yīng)大小的重組蛋白，如圖4所示，其相對(duì)分子質(zhì)量和理論計(jì)算值基本吻合.

圖4 融合蛋白的純化Fig.4 Purification of fusion protein

3 討論與結(jié)論

本研究從已構(gòu)建的青蛤ESTs庫(kù)中篩選得到親環(huán)素A基因cDNA的全長(zhǎng)序列，對(duì)該序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)親環(huán)素A含有一個(gè)完整的Pro_isomeraes結(jié)構(gòu)域，為親環(huán)素A的典型結(jié)構(gòu)域.在已知的櫛孔扇貝的CypA基因中同樣存在一個(gè)完整的Pro_isomeraes結(jié)構(gòu)域[10]，它能夠加速自身折疊、體內(nèi)新生肽鏈折疊及變性蛋白質(zhì)的體外折疊，具有分子伴侶的作用.

鰻弧菌是海洋動(dòng)物中最常見的一種致病微生物，貝類被其侵染后會(huì)出現(xiàn)出血性敗血癥，進(jìn)而導(dǎo)致其局部組織損傷乃至死亡[11].相關(guān)研究顯示[12]，低濃度的鰻弧菌對(duì)青蛤進(jìn)行刺激后，與免疫相關(guān)的因子如熱休克蛋白、磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶等基因在一定時(shí)間內(nèi)均發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，且其血清中的各種免疫相關(guān)酶蛋白的含量也隨之升高.本研究利用熒光定量PCR方法分析了青蛤血淋巴CypA基因在鰻弧菌刺激后的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組青蛤CypA基因的表達(dá)量在鰻弧菌刺激后3h開始呈上升趨勢(shì)并達(dá)到最大值，與對(duì)照組的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01），96h時(shí)表達(dá)量基本恢復(fù)到正常水平.這表明青蛤血淋巴中的CypA在鰻弧菌刺激下能夠大量表達(dá)，暗示其可能在血淋巴中具有防御細(xì)菌感染的特殊作用.例如在斑點(diǎn)叉尾鮰的卵細(xì)胞系中，CypA基因受到愛德華氏菌（Edwardsiella Ictaluri）感染后表達(dá)量上調(diào)，證明其在愛德華氏菌感染的早期階段有重要作用[13].近年來(lái)在斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus Monodon）中也發(fā)現(xiàn)了親環(huán)素A基因，受到LPS刺激后在肝胰腺中表達(dá)量上調(diào)[14].由此推測(cè)CypA基因參與了青蛤的先天性免疫反應(yīng)，尤其是在抵抗不良環(huán)境因子的過程中發(fā)揮了重要作用.

本研究以pET-30α作為表達(dá)載體系統(tǒng)，構(gòu)建出了pET30α（+）-CypA重組質(zhì)粒，并通過T7啟動(dòng)子和1個(gè)6×His標(biāo)簽來(lái)控制表達(dá)的嚴(yán)謹(jǐn)性.研究最終得到了相對(duì)分子質(zhì)量在19 kDa左右的目的蛋白，其結(jié)果與預(yù)測(cè)的CsCypA相對(duì)分子質(zhì)量理論值19.39 kDa相當(dāng)吻合.本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示青蛤的免疫防御體系，選育抗病抗逆的青蛤優(yōu)質(zhì)品種奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

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