一種簡便高效提取兩棲動物肌肉組織基因組DNA的方法

李佳璇，陳 卓，朱艷軍，何玉曉，陳曉虹

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

在動物的系統(tǒng)發(fā)育研究中，動物標本采集和組織樣本保存是研究的基礎(chǔ)，提取一定濃度和高質(zhì)量的基因組DNA是影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵.在兩棲動物野外考察和標本采集過程中，為獲得大數(shù)據(jù)樣本，避免標本腐爛和DNA降解，取肌肉組織于體積分數(shù)95%的乙醇溶液中固定是樣本保存的有效方法[1-2].在DNA提取過程中，徹底去除肌肉組織中的乙醇，以蛋白酶K裂解組織細胞，采用酚-氯仿抽提是最經(jīng)典和常規(guī)的方法[3]，具有成本低、有效去除蛋白、DNA純度高、可滿足各種實驗要求等優(yōu)點[4]，但實驗耗時長、效率低的特點也較突出.為此本研究介紹一種簡單、高效提取兩棲動物肌肉組織基因組DNA的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

臭蛙屬（Odorrana）的6個物種：大綠臭蛙（Odorrana graminea）、花臭蛙（O.schmackeri）、宜章臭蛙（O.yizhangensis）、合江臭蛙（O.hejiangensis）、黃崗臭蛙（O.huanggangensis）、海南臭蛙（O.hainanensis）.肌肉組織作為實驗材料，以體積分數(shù)為95%的乙醇溶液固定，－20℃冰箱保存.

1.2 試劑

裂解緩沖液：體積分數(shù)10%的SDS，0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0），1 mol/L 的 Tris-HCL（pH 8.0）.

其他：20 g/L蛋白酶K，Tris-平衡酚，氯仿異戊醇混合液（體積比為24∶1），體積分數(shù)95%的無水乙醇，3 g/L的NaAc，滅菌雙蒸水.

1.3 方法

常規(guī)酚-氯仿抽提法[3]稍加改進.

脫醇：取50 mg肌肉組織放入1.5 mL Eppendorf管中，加滅菌雙蒸水，用灼燒過的剪刀將肌肉剪碎（越碎越好），每隔30 min更換滅菌雙蒸水，總共3次.

消化：吸除Eppendorf管中的雙蒸水，加入500μL裂解緩沖液及6～7μL的20 g/L的蛋白酶K，置于55℃水浴鍋中消化.在消化的第1h內(nèi)，每隔10 min混勻1次，加快消化速度.消化時間根據(jù)消化程度而定，大約3～4h.

Tris-平衡酚抽提：4℃、5 000 r/min條件下，將消化后的組織液離心5 min，取上清液至新的Eppendorf管中，加入等體積的Tris-平衡酚（約500μL），旋轉(zhuǎn)器上搖勻10 min，在4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，上清液移至新的Eppendorf管中.

混合抽提：加入Tris-平衡酚和氯仿異戊醇混合液各 250μL，顛倒混勻 10 min，在 4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液至新的Eppendorf管中.

氯仿異戊醇抽提：加入等體積的氯仿異戊醇，顛倒混勻10 min，4℃、8 000 r/min條件下離心15 min.將上層水相小心轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中.

沉淀：加入4℃、0.1倍體積濃度為3 mol/L的NaAc（約50μL）、2.5倍體積冷凍的無水乙醇（約1 mL），旋轉(zhuǎn)混勻.置于-20℃冰箱，沉淀3h以上.

保存：在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min后棄掉溶液，烘干，加入50μL滅菌雙蒸水在4℃冰箱保存.

從樣品脫醇到提取基因組DNA，總耗時約12h.

1.4 基因組DNA的檢測

取2μL基因組DNA稀釋液，用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA片段大小及降解情況.

1.5 PCR擴增檢測

設(shè)計2對線粒體12S和16S rDNA引物，進行PCR擴增，反應(yīng)體系總體積25μL，包括：18.8μL的滅菌雙蒸水，2.5μL的 10×buffer，2μL的三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTP）溶液，各0.5μL的上游和下游引物，0.5μL的樣品DNA，0.2μL的TaqDNA聚合酶.

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min.反應(yīng)結(jié)束，取2μL擴增產(chǎn)物于質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取結(jié)果

用改進的方法提取6種臭蛙的肌肉組織DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，基因組DNA條帶均清晰、明亮、整齊，如圖1所示.

圖1 提取臭蛙類肌肉組織基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA from muscle tissues of odor frogs

2.2 PCR擴增及檢測

利用線粒體引物擴增6種臭蛙的12S、16S rDNA基因片斷，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，都表現(xiàn)出單一明亮的條帶，如圖2所示.

圖2 PCR擴增的12Sr DNA和16Sr DNA基因片斷Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified 12Sr DNA and 16Sr DNA

3 討論

目前，國內(nèi)外常規(guī)的基因組DNA提取方法主要有CTAB法[5-7]、異丙醇沉淀法[8]和SDS-蛋白酶K法[3]等，不同提取方法的主要區(qū)別在于裂解組織樣品的方法不同.其中CTAB法主要采用CTAB抽提緩沖液處理和液氮冷卻快速研磨裂解組織樣品，主要用于植物和微生物基因組DNA的提取[5-7]；經(jīng)典的SDS-蛋白酶K法采用SDS抽提緩沖液和蛋白酶K充分裂解組織樣品，主要用于動物組織DNA的提取[1-5]，該方法1次提取需耗時2～3 d，大量時間用于去除組織中的乙醇（10～15h）和消化裂解蛋白質(zhì)（8～14h）.為此，莫邦輝等[9]提取角蟾屬蝌蚪尾部肌肉的DNA時，嘗試不經(jīng)蛋白酶K消化，直接用化學(xué)試劑SDS裂解細胞提取DNA，該方法比較省時，從之前的幾天縮短至3h，然而提取的DNA模板產(chǎn)率較低，只適合短片段PCR擴增.

本研究在運用酚-氯仿抽提蛙類肌肉基因組DNA的過程中，在方法上做了部分改進，達到簡化實驗過程、縮短時間、提高DNA純度的目的.具體包括：在滅菌雙蒸水中將肌肉組織剪碎呈糊狀，為防止殘留乙醇影響蛋白酶K，頻繁更換雙蒸水，使脫醇時間縮短至1～2h；加大裂解緩沖液中 SDS、EDTA、Tris-HCL 的濃度，通過定時混勻加快消化速度（3～4h），提高實驗效率；在沉淀過程中，加入4℃、0.1倍體積的3 mol/L的NaAc和-20℃、2.5倍體積的無水乙醇，可加速DNA析出，提高DNA濃度.改進后的整個DNA提取過程耗時10～12h，同傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法相比，節(jié)省約12～24h.在兩棲動物的分子系統(tǒng)發(fā)育研究中，是一種高效、省時、低成本的提取肌肉組織DNA的方法.

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