雙氧水對聚蘋果酸脫色效果探究

孟迪，喬長晟，2，*，宋玉民，范栩嘉，徐碩涵

（1.天津科技大學工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津300457）

雙氧水對聚蘋果酸脫色效果探究

孟迪1，喬長晟1，2，*，宋玉民1，范栩嘉1，徐碩涵1

（1.天津科技大學工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津300457）

研究了雙氧水對聚蘋果酸脫色及其對聚蘋果酸的影響，確定最佳脫色工藝。結(jié)果以脫色效果、聚蘋果酸損失率和分子量為指標，在單因素篩選的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法對脫色工藝進行優(yōu)選，并對聚蘋果酸進行結(jié)構(gòu)表征。最終確定脫色最佳工藝為：雙氧水添加量15%（體積比）、溫度60℃、時間4 h、pH 10；紅外光譜和核磁共振結(jié)果顯示雙氧水處理后部分聚蘋果酸氧化。且純度比未用雙氧水處理時要高，可以選用此種方法進行快速有效的脫色。

過氧化氫；聚蘋果酸；紅外光譜分析；核磁共振

聚蘋果酸（Poly malic-acid，簡稱PMLA）是以蘋果酸為唯一單體的均聚高分子聚合物。由于蘋果酸含有兩個羧基和一個羥基，其相互酯化的產(chǎn)物主要有3種，即α型、β型、γ型，生物體內(nèi)存在的只有β型。聚蘋果酸具有優(yōu)良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性，它可在水溶液中自發(fā)或酶促降解生成小分子L-蘋果酸，該單體通過三羧酸循環(huán)［1］很容易地從人體內(nèi)代謝出來并無任何毒副作用。聚蘋果酸分解或燃燒后，最終產(chǎn)物是二氧化碳和水，可被植物吸收，對環(huán)境無毒無害［2］。聚蘋果酸的這些特有的性質(zhì)使其在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理以及香精香料等許多方面有著廣闊的應(yīng)用前景。目前聚蘋果酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法［3］，化學合成法工藝復雜、有機溶劑殘留難以去除；而發(fā)酵法生產(chǎn)聚蘋果酸成為國內(nèi)近年來研究比較熱的課題。發(fā)酵液是一種非常復雜的多元混合體系，色素是其中的一類。發(fā)酵液中的色素來源主要有3種：一是原料本身帶有的；二是來自于發(fā)酵過程中的菌體代謝；三是產(chǎn)生于發(fā)酵液某些成分的相互反應(yīng)，例如殘?zhí)桥c溶液中的含氮物質(zhì)在高溫下反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)［4-6］。色素的存在不僅影響產(chǎn)品的外觀，而且涉及產(chǎn)品是否符合標準，所以，脫色是提取發(fā)酵液中聚蘋果酸的必要步驟。因此，從發(fā)酵液中提取色素較少的聚蘋果酸是一個重要的課題。本文對雙氧水的脫色條件做了系統(tǒng)研究，并進一步探究使用雙氧水脫色對聚蘋果酸的影響，得到了雙氧水在聚蘋果酸提取脫色中的優(yōu)化條件及其對聚蘋果酸分子量和結(jié)構(gòu)的影響。

1材料與方法

1.1材料

聚蘋果酸發(fā)酵液：本研究室經(jīng)5L發(fā)酵罐發(fā)酵提供，pH6.5～7.0，聚蘋果酸在發(fā)酵液中以鈣鹽形式存在，含量40 g/L左右。

30%雙氧水（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；葡聚糖（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；L-蘋果酸（分析純）：百靈威科技有限公司；無水甲醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市化學試劑一廠；乙腈（色譜純）：天津市索祥化學品有限公司；硫酸鈉（分析純）：維科特（天津）化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備

UV-1800PC紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；SC6010電子天平、FE20pH計：梅特勒-托利多常州衡器有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；VECTOR22型傅里葉變換紅外光譜：布魯克儀器公司；AVANCE型核磁共振譜儀：布魯克拜厄斯賓有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1聚蘋果酸的提取與精制

將發(fā)酵液4 200 r/min離心30 min，去菌體，向上清中按體積比添加甲醇，添加量為20%（體積比）將沉淀出的部分多糖去除后再繼續(xù)添加甲醇使其添加量達到60%（體積比）此時得到的沉淀即為聚蘋果酸量較高的聚蘋果酸粗品，其純度可以達到67.3%。取聚蘋果酸粗品溶解100 mL水中加普魯蘭多糖酶水解普魯蘭多糖，水解條件是水解時間為60 min、添加量為2.5%（體積比）、水解溫度為55℃。繼而超濾去除離子和小分子多糖［7］，此時純度達到86.5%。稱取上述聚蘋果酸樣品20 g，加1 000 mL蒸餾水，攪拌使充分溶解，考慮雙氧水有較強的氧化性而破壞聚蘋果酸樣品，故實驗以脫色效果、聚蘋果酸損失率和聚蘋果酸分子量為測定指標。

1.3.2脫色率的計算

對聚蘋果酸發(fā)酵液進行了可見-紫外光譜700 nm～200 nm的掃描，結(jié)果表明溶液無最大吸收波長，根據(jù)聚蘋果酸溶液脫色前后均為橙黃色，故從溶液的互補色考慮選擇450 nm為檢測波長測定其吸收度。并按下式計算脫色率：

式中：A為脫色前吸光度；A0為脫色后吸光度。

1.3.3聚蘋果酸含量的檢測

采用水解的方法將聚蘋果酸水解成蘋果酸單體，再采用反向高效液相色譜的方法測定水解液中蘋果酸的含量，并折算成聚蘋果酸的含量，進而計算聚蘋果酸的損失率。

1.3.3.1液相流動相的配制

準確秤取磷酸二氫鉀3.402 5 g，溶于娃哈哈純凈水中，定容1 000 mL，配成0.025 mol/L的磷酸二氫鉀溶液。將該溶液與乙腈以95∶5（體積比）的比例混合均勻后，將該混合溶液的pH調(diào)至2.0。

1.3.3.2聚蘋果酸的預處理

將聚蘋果酸樣品配成適當?shù)臐舛?，將該溶液與1 mol/L的硫酸以1∶1（體積比）的比例混合均勻置于90℃烘箱內(nèi)水解9 h。將得到的水解液進行粗過濾后，再用0.22 μm的濾膜過濾。

1.3.3.3標準曲線的制作

用流動相分別精確配置1、2、4、6、8、10 g/L等不同濃度的標準L-蘋果酸溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，利用液相色譜檢測，檢測條件為：進樣5 μL，流速1 mL/min，柱溫25℃，檢測波長210 nm，得出色譜圖，得出峰面積，以質(zhì)量濃度（y）對樣品峰面積（X）進行線性回歸，得回歸方程：y=214.2X+6.758，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。

1.3.3.4聚蘋果酸樣品的測定

將水解后并過膜的水解液用液相色譜檢測，檢測條件同上，記錄峰面積，將得到的峰面積與標準曲線進行對比得出水解液中蘋果酸的濃度，將此蘋果酸的濃度經(jīng)過折算得到樣品中聚蘋果酸的百分含量。并按下式計算損失率：

式中：C0為發(fā)酵液中聚蘋果酸百分含量；C為雙氧水脫色后發(fā)酵液中聚蘋果酸百分含量。

1.3.4聚蘋果酸分子量的測定

1.3.4.1流動相配制

0.05mol/L硫酸鈉：精確稱取7.102 5 g硫酸鈉于燒杯中用娃哈哈水溶解并定容至1 L。

1.3.4.2聚蘋果酸的處理

將聚蘋果酸樣品用流動相稀釋到適當?shù)臐舛龋?.45 μm的水膜過濾后，置于進樣瓶中備用。

1.3.4.3標準曲線的制作

用流動相分別精確配置2 g/L等不同分子量的標準葡聚糖溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，利用液相色譜檢測，檢測條件為：進樣20 μL，流速0.5 mL/min，柱溫25℃，檢測器溫度30℃，得出色譜圖，繪制標準曲線。

1.3.4.4聚蘋果酸樣品的測定

將上述處理過的聚蘋果酸樣品用液相色譜檢測，檢測條件同上，根據(jù)出峰時間及標準曲線進行積分得到Mw。

1.3.5聚蘋果酸核磁共振掃描

1H NMR頻率400.13 MHz，90℃脈沖25 μs，脈沖延遲時間3.6 s，累加100次，溶劑D2O，樣品稱取50 mg溶至500 μL重水中，控溫誤差±0.1℃。

13C NMR頻率100.62 MHz，90℃脈沖14 μs，脈沖間隔1.5 μs，寬帶噪音去偶，累加65 000次，溶劑D2O，樣品稱取80 mg溶至500 μL重水中，控溫誤差±0.1℃［8］。

1.3.6紅外光譜掃描［9］

1.3.6.1樣品的制備

將光譜級KBr磨細干燥，置于干燥器中備用，取1 mg～2 mg干燥樣品，并以1：（100-200）（g/g）比例的干燥KBr粉末，一起在瑪瑙研缽中于紫外燈下研磨，直到完全研磨混勻（粉末粒徑2 μm左右）。將研好的粉末均勻放入壓膜器內(nèi)，抽真空后，加壓至50 MPa～100 MPa，得到透明或半透明的薄片。

1.3.6.2檢測

將制備好的樣品薄片置于樣品架上，即可進行紅外光譜測試，掃描范圍為4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16。由于KBr吸濕性強，不可避免會有游離水的吸收峰出現(xiàn)，為了扣除KBr的吸收，在同樣條件下制備同樣厚度的KBr薄片作參比。

2結(jié)果與分析

2.1時間對脫色效果的影響

取10 mL聚蘋果酸溶液置于25 mL三角瓶中，加入3%的30%過氧化氫，50℃，不同反應(yīng)時間，冷卻，分別測在450 nm處的吸光值以計算其脫色率并液相檢測聚蘋果酸含量、分子量。結(jié)果見表1。

由表1可以看出，隨著時間的增加，脫色效果增大明顯，但在8 h后變化不大，而PMLA損失率逐漸增大，分子量逐漸降低，在8 h后損失率和分子量變化幅度很大，所以脫色時間應(yīng)不超過8 h。

2.2pH對脫色效果的影響

取10 mL聚蘋果酸溶液置于25 mL三角瓶中，加入3%的30%過氧化氫，用鹽酸調(diào)pH，50℃，在不同的pH條件下反應(yīng)4 h，冷卻，分別測在450 nm處的吸光值以計算其脫色率并液相檢測聚蘋果酸含量、分子量。結(jié)果見表2。

表1　脫色時間對雙氧水脫色效果、PMLA損失率和分子量的影響Table 1Influence of time on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

表2　pH對雙氧水脫色效果、PMLA損失率和分子量的影響Table 2Influence of pH on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

由表2可以看出，脫色率隨pH的升高而增加，在酸性和強堿性條件下PMLA損失很大，且分子量降低明顯，因為聚蘋果酸在酸性條件下容易水解，所以分子量有所降低，而雙氧水在水溶液中電離出過氧氫根離子攻擊色素和聚蘋果酸，在堿性條件下，其電離度增大，所以脫色作用增強的同時聚蘋果酸的損失率增加、分子量降低。因此脫色pH應(yīng)控制為9左右。

2.3溫度對脫色的影響

取10 mL聚蘋果酸溶液置于25 mL三角瓶中，加入3%的30%過氧化氫，不同溫度條件下反應(yīng)4 h，冷卻，分別測在450 nm處的吸光值以計算其脫色率并液相檢測聚蘋果酸含量、分子量。結(jié)果見表3。

表3　溫度對雙氧水脫色效果、PMLA損失率和分子量的影響Table 3Influence of temperature on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

由表3可以看出，脫色率隨著溫度的升高而升高，在80℃后，變化不大，說明雙氧水對聚蘋果酸溶液中色素的吸附趨于平衡，而隨溫度升高聚蘋果酸損失率升高、分子量降低。綜合脫色率、聚蘋果酸損失率和聚蘋果酸分子量變化，應(yīng)將脫色溫度控制在60℃左右。

2.4雙氧水用量對脫色的影響

取10 mL聚蘋果酸溶液置于25 mL三角瓶中，調(diào)pH 9～10，50℃，加入不等量雙氧水反應(yīng)4 h，冷卻，分別測在450 nm處的吸光值以計算其脫色率并液相檢測聚蘋果酸含量、分子量。結(jié)果見表4。

表4　雙氧水用量對雙氧水脫色效果、PMLA損失率和分子量的影響Table 4Influence of the amount of H2O2on decoloration，loss ratio and molecular weight of PMLA

由表4可以看出，脫色率隨著雙氧水用量的升高而升高，然而，隨著雙氧水用量的增高，聚蘋果酸損失率增加、分子量降低，在用量為聚蘋果酸溶液體積的30%后，光密度值變化不大，而在用量為30%以后，聚蘋果酸損失率急劇增加、分子量降低幅度明顯變大，說明雙氧水用量不宜過大，用量應(yīng)控制為30%以內(nèi)。

2.5正交試驗因素水平表的設(shè)計與試驗

按單因素試驗的結(jié)果，選擇pH、溫度、時間、雙氧水用量按L18（37）安排正交試驗。因素水平設(shè)計見表5。

表5　正交試驗設(shè)計各因素及水平Table 5Levels of factors used in the orthogonal experimental design

稱聚蘋果酸粗品10 g，加500 mL水溶解，分別取10 mL聚蘋果酸溶液置于25 mL三角瓶中，按正交試驗方案進行脫色，冷卻，定容，測定脫色率、聚蘋果酸損失率和分子量，以三者作為衡量脫色效率的指標。試驗結(jié)果及方差分析見表6～表8。

表6　正交試驗表及結(jié)果Table 6Orthogonal analysis test

圖1　不同處理方式下的PMLA的核磁共振C譜圖Fig.113C-NMR spectrum of PMLA by different treatment methods

表7　脫色率方差分析表Table 7The anova table of decoloring rate

表8　聚蘋果酸損失率方差分析表Table 8The anova table of loss ratio of PMLA

圖2　不同處理方式下的PMLA的核磁共振H譜圖Fig.21H-NMR spectrum of PMLA by different treatment methods

表9　聚蘋果酸分子量方差分析表Table 9The anova table of molecular weight of PMLA

由表7～表9可看出，雙氧水對脫色率、損失率和分子量的影響因素分別為A＞D＞B＞C、B＞D＞A＞C和A＞B＞C＞D，其中A因素各水平對脫色率和分子量均有顯著差異，B因素各水平對損失率有顯著差異，由于因素C和D沒有顯著性差異，考慮以脫色率為主，同時縮短時間，提高效率，故最佳脫色條件為的較優(yōu)水平組合為A2B2C1D3。

2.6驗證試驗

取10 mL聚蘋果酸溶液置于25 mL三角瓶中，按正交試驗所得結(jié)果得出脫色的最佳條件進行，測得脫色率、聚蘋果酸損失率和分子量分別為92.1%、10.8%和5 011。結(jié)果表明實驗所確定的工藝為最佳工藝條件。其中，該條件下處理的聚蘋果酸液相檢測其純度為90.1%，比未經(jīng)雙氧水處理的純度略高。

2.7核磁共振掃描和紅外光譜檢測

在進行核磁檢測時采用的D2O溶解聚蘋果酸，所以會形成氫鍵產(chǎn)生一些雜峰影響結(jié)果，但圖1（a）和圖1（b）對比，發(fā)現(xiàn)PMLA經(jīng)雙氧水處理與不處理之后的C譜結(jié)果差異很小，說明經(jīng)雙氧水處理后的聚蘋果酸基本結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化；圖2（a）和圖2（b）對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙氧水處理過的PMLA在2.0×10-6出現(xiàn)弱峰，其它均一致，其中1.5×10-6～2.5×10-6是羰基區(qū)域，可能是雙氧水氧化聚蘋果酸造成的；圖3（a）和圖3（b）的紅外結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)雙氧水處理后的聚蘋果酸在2 339.06 cm-1處出現(xiàn)較弱的吸收峰，而頻率范圍在2 500 cm-1～2 000 cm-1區(qū)為三鍵或者累積雙鍵區(qū)，可能是聚蘋果酸發(fā)生部分氧化，此結(jié)果與核磁共振H譜結(jié)果一致。

圖3　不同處理方式下的PMLA的紅外光譜圖Fig.3Infrared spectra of PMLA by different treatment methods

3討論

聚蘋果酸提取物的脫色方法有活性炭法、雙氧水法和樹脂脫色法?；钚蕴棵撋a(chǎn)品顏色較重，且脫色后溶液中的活性炭殘渣難于完全除去，但是，使用該方法進行脫色對提取物影響效果小，屬于物理吸附；樹脂脫色效果最好，脫色工藝簡單，但樹脂價格較高，一次性投資較大，且需再生使用，生產(chǎn)周期較長，適合少量樣品的脫色，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)；雙氧水脫色操作簡便，脫色效果較好，產(chǎn)品顏色較淺，但對聚蘋果酸具有較強的氧化作用，因此在使用時一定要控制好條件。

［1］宋超，張立軍，賈永光，等．植物的蘋果酸代謝和轉(zhuǎn)運［J］．植物生理學通訊，2009，45（5）:419-428

［2］劉建軍，姜魯燕，趙祥穎，等．L-蘋果酸的應(yīng)用及研究進展［J］．中國食品添加，2003，32（3）:53-56

［3］Lee B S，Vert M，Holler E．Biopolymer:Vol.3［M］.Weinheim:Wiley-VCH，2002:75-103

［4］樓良旺，高年發(fā)．丙酮酸發(fā)酵液脫色工藝的研究［J］．廣州食品工業(yè)科技，2004，20（3）:12-14

［5］范峰辛，體明友．長鏈二元酸的提取工藝研究［J］．精細與專用化學品，2004，12（23）:25-27

［6］周衛(wèi)斌，周樣山．畢赤酵母發(fā)酵液的脫色和重組水蛭素的分離［J］．生物工程學報，2001，17（6）:683-686

［7］牛登飛．發(fā)酵液中普魯蘭多糖提取工藝條件的研究［D］．無錫:江南大學，2009:12-16

［8］王雪松．出芽短梗霉原生質(zhì)體激光誘變及普魯蘭的純化和表征［D］．吉林:吉林大學，2003:34-35

［9］朱淮武．有機分子結(jié)構(gòu)波譜解析［M］．北京:化學工業(yè)出版社，2010: 29-31

Study of Decoloration Effect on Poly Malic Acid by H2O2

MENG Di1，QIAO Chang-sheng1，2，*，SONG Yu-min1，F(xiàn)AN Xu-jia1，XU Shuo-han1
（1.Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Beiyang Biotrans Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

The objective of this study was to discuss the decolorization effect on poly malic acid by H2O2and determine the optimal bleaching process.The decolorization effect，loss ratio and molecular weight of PMLA were used as indexes.Based on the single factor experiment，the orthogonal design was applied to select the optimal condition for the decolorization of PMLA.The apparent structure of PMLA was determined under this optimal condition.As a result，the optimal extraction conditions were as follows：the volume addition of H2O2was 15%，the temperature was 60℃，the bleaching time was 4 hours and the bleaching pH was 10.The result of FT-IR and HMR showed that the PMLA dealt with H2O2was partly oxidized.The purity of PMLA was higher than untreated with H2O2.This kind of method can be chosen for fast and efficient decolorization.

H2O2；poly malic acid；FT-IR；NMR

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.009

2014-09-01

孟迪（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：氨基酸與有機酸發(fā)酵。