超聲微波協(xié)同萃取法提取菊苣酸條件研究

王英超，王蕾，金紅，*，李秋闖，楊孝麗

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384）

超聲微波協(xié)同萃取法提取菊苣酸條件研究

王英超1，王蕾2，金紅2，*，李秋闖2，楊孝麗2

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384）

利用超聲微波協(xié)同萃取對(duì)紫錐菊中菊苣酸最佳提取條件進(jìn)行研究。采用新鮮的紫錐菊根部，考察乙醇濃度、微波提取時(shí)間、微波提取功率、料液比等因素對(duì)紫錐菊中菊苣酸提取含量的影響，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件。結(jié)果表明：濃度為50%乙醇、料液比1∶25 g/mL、微波提取時(shí)間660 s、微波提取功率300 W和提取次數(shù)為1次為最佳提取條件。在最佳提取條件下進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到菊苣酸平均含量為158.4 μg/g。

紫錐菊；菊苣酸；超聲微波協(xié)同萃取

紫錐菊（Echinacea purpurea）是原產(chǎn)于美洲的一類菊科野生花卉，也稱“松果菊”［1］。全株具有很高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值［2］。我國于20世紀(jì)70年代開始引入，已在北京、南京、上海等地引種成功。盡管引種時(shí)間短，但各行業(yè)對(duì)其的研究進(jìn)展均較快［3］。菊苣酸是紫錐菊中極為重要的免疫活性成分之一，具有增強(qiáng)免疫功能和抗炎作用，并能抑制透明質(zhì)酸酶，保護(hù)膠原蛋白免受可導(dǎo)致降解的自由基的影響［4］。菊苣酸的提取方法主要有：超聲波法、聚酰胺法、相轉(zhuǎn)移萃取法、正交實(shí)驗(yàn)法［5-8］。目前還沒有利用超聲-微波協(xié)同萃取紫錐菊中菊苣酸的研究報(bào)道。本工作以天津地區(qū)栽植的一年生紫錐菊植株為研究對(duì)象，通過超聲微波協(xié)同萃取法萃取其中的有效成分—菊苣酸，并利用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，為菊苣酸的提取方式提供新依據(jù)，也為天津地區(qū)藥企栽植利用紫錐菊提供參考。

1材料與方法

1.1材料

紫錐菊：采自天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)肥水管理及病蟲害防治，待生長至收獲期，選取生長大小一致，無病害的紫錐菊根部作為試驗(yàn)材料。使用前對(duì)根部進(jìn)行清洗備用。

1.2試劑

無水乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；0.1%冰醋酸（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：天津市江天化工技術(shù)有限公司；菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：北京百靈威科技有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

1200 Series Agilent高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；FA-2004電子天平：上海方瑞儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀：美國密理博（中國）有限公司；CW-200超聲-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；Haier BCD-241WE/Y冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.4方法

1.4.1不同乙醇濃度對(duì)菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶25 g/mL的比例，分別加入20%乙醇、35%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、無水乙醇于各個(gè)萃取瓶中進(jìn)行提取。程序如下：超聲90 s，無微波功率；關(guān)掉超聲，微波300 s、功率300 W。待反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾液于4℃條件下12 000 r/min離心10 min。上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜，濾出液作為高效液相色譜儀進(jìn)樣樣品使用。以菊苣酸的含量（μg/g）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討不同乙醇濃度對(duì)提取菊苣酸含量的影響。

菊苣酸的含量（μg/g）=樣品中菊苣酸的含量（μg/ mL）×提取液總體積（mL）÷取樣量（g）

1.4.2不同的料液比對(duì)提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按不同料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）加入不同體積的50%乙醇于各個(gè)萃取瓶中進(jìn)行提取。程序如下：超聲90 s，無微波功率；關(guān)掉超聲，微波300 s、功率300 W。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進(jìn)行，探討不同的料液比對(duì)提取菊苣酸含量的影響。

1.4.3不同的微波萃取時(shí)間對(duì)提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于各個(gè)萃取瓶中進(jìn)行不同微波時(shí)間提取。程序如下：（1）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波180s、功率300 W。（2）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波300 s、功率300 W。（3）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波420 s、功率300 W。（4）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540 s、功率300 W。（5）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波660 s、功率300 W。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進(jìn)行，探討不同的微波提取時(shí)間對(duì)提取菊苣酸含量的影響。

1.4.4不同的微波功率對(duì)提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于各個(gè)萃取瓶中進(jìn)行不同微波功率（200、300、400、500、600 W）的提取。程序如下：（1）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540 s、功率200 W。（2）超聲90s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540s、功率300 W。（3）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540 s、功率400 W。（4）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540 s、功率500 W。（5）超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540 s、功率600 W。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進(jìn)行，探討不同的微波功率對(duì)提取菊苣酸含量的影響。

1.4.5不同的提取次數(shù)對(duì)提取菊苣酸含量的影響

選取新鮮的紫錐菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于萃取瓶中進(jìn)行不同次數(shù)的提取。反應(yīng)程序如下：超聲90 s、無微波功率；關(guān)掉超聲，微波540 s、功率300 W。提取一次后，將濾后的紫錐菊根吸干表面液體，繼續(xù)按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL再次進(jìn)行提取并重復(fù)上述過程。每次提取結(jié)束后均將濾液4℃下，12 000 r/min離心10 min。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進(jìn)行，探討不同的提取次數(shù)對(duì)提取菊苣酸含量的影響。

1.4.6高效液相色譜條件［9］

分離柱：XDB-C18（4.6×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈：0.1%冰醋酸=25∶75（體積比）；流動(dòng)相速度：0.2 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長330 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.4.7菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將1 mg/mL的菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，樣品濃度為0.5、2.5、25、50、100 μg/mL。按照其上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，以峰面積為縱坐標(biāo)，菊苣酸的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.8正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇微波功率、時(shí)間和料液比三因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。具體設(shè)計(jì)見表1。

表1　三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1The design of three factors and three levels of orthogonal test

1.4.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1　菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1The standard curve of cichoric acid

圖2　菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of cichoric acid

菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1，從圖1可以看出，菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=20.13x-28.359，R2=0.990 7，式中：y為峰面積，（mAU·s）；x為菊苣酸濃度，（μg/mL），可以看出方程線性關(guān)系明顯。圖2為菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。從圖2可以看出，菊苣酸的出峰時(shí)間在3.524 min。

2.2不同乙醇濃度對(duì)提取菊苣酸含量的影響

不同乙醇濃度對(duì)菊苣酸提取含量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同乙醇濃度對(duì)菊苣酸提取含量的影響Fig.3Effect of different concentration of ethanol on the content of cichoric acid extraction

從圖3中可以看出，隨著乙醇濃度的增加，菊苣酸的含量逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，菊苣酸含量達(dá)到最大值229.8 μg/g。當(dāng)乙醇濃度高于50%時(shí)，菊苣酸含量逐漸遞減，最低值為12 μg/g。這可能與微波加熱的機(jī)理有關(guān)，提高乙醇濃度可以增加提取劑對(duì)物料的滲透性，從而提高得率。但進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取時(shí)，主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量使物料升溫，乙醇濃度增加減小了料液中水的比例，使物料升溫減慢從而影響得率［10-12］。因此選擇50%乙醇作為提取溶劑。

2.3不同的料液比對(duì)菊苣酸提取含量的影響

不同料液比對(duì)菊苣酸提取含量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同料液比對(duì)菊苣酸提取含量的影響Fig.4Effects of different ratio of material to liquid on the content of cichoric acid extraction

從圖4可以看出，隨著料液比的逐漸升高，提取的菊苣酸含量逐漸上升，當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí)，菊苣酸含量達(dá)到最高，數(shù)值為171 μg/g。繼續(xù)升高料液比，菊苣酸含量降低。當(dāng)料液比為1∶15 g/mL時(shí)，菊苣酸含量為150 μg/g。其原因可能是提取溶劑對(duì)微波能量的吸收增大，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)微波能量吸收減少，細(xì)胞破裂不完全［12］，菊苣酸釋放量少。所以選擇1∶20 g/mL為最佳料液比。

2.4不同的微波提取時(shí)間對(duì)菊苣酸提取含量的影響

不同的微波提取時(shí)間對(duì)菊苣酸提取含量的影響如圖5所示。

圖5　不同微波萃取時(shí)間對(duì)菊苣酸提取含量的影響Fig.5Effects of different extraction time on the content of cichoric acid extraction

從圖5中可以看出隨著時(shí)間的增加，菊苣酸的含量也在逐漸增大。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到540 s時(shí)，提取的菊苣酸含量最大，數(shù)值為115.9 μg/g。超過540 s后，菊苣酸含量呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谖⒉〞r(shí)間過長，部分菊苣酸被破壞，導(dǎo)致菊苣酸含量降低。所以微波萃取的最佳時(shí)間為540 s。

2.5不同的微波提取功率對(duì)菊苣酸提取含量的影響

不同的微波萃取功率對(duì)菊苣酸提取含量的影響如圖6所示。

圖6　不同微波提取功率對(duì)菊苣酸提取含量的影響Fig.6Effect of microwave power on the content of Cichoric Acid extraction

從圖6可以看出，隨著微波功率的增加，提取的菊苣酸的含量也在逐漸增加。在300 W時(shí)提取的菊苣酸含量達(dá)到最大值143.9 μg/g。超過300 W后，菊苣酸的含量明顯下降。這是因?yàn)橥饧与妶?chǎng)作用增強(qiáng)，分子熱運(yùn)動(dòng)作用增大，得到菊苣酸的提取含量較高；隨著功率繼續(xù)增大，提取的菊苣酸容易發(fā)生變質(zhì)，增加能耗。綜合以上因素，所以選擇300 W作為最佳微波提取功率。

2.6不同的提取次數(shù)對(duì)菊苣酸提取含量的影響

不同的提取次數(shù)對(duì)菊苣酸提取含量的影響的結(jié)果如圖7所示。

圖7　不同提取次數(shù)對(duì)菊苣酸含量的影響Fig.7Effect of extraction times on the content of Cichoric Acid extraction

從圖7可以看出，在同一條件下，隨著提取次數(shù)的增加，菊苣酸的含量逐漸降低，提取1次時(shí)，菊苣酸的含量115.9 μg/g，提取第2次時(shí)，菊苣酸含量為0 μg/g。說明提取1次可以將根部中的菊苣酸提取完全。故而選擇提取1次為最佳提取次數(shù)。

2.7正交試驗(yàn)法優(yōu)化試驗(yàn)

通過對(duì)單一因素的篩選，我們確定了兩個(gè)因素水平：提取溶劑為50%乙醇，提取次數(shù)為一次。另外3個(gè)因素對(duì)菊苣酸含量影響較大，所以我們選擇微波提取時(shí)間、微波功率和料液比3因素做正交試驗(yàn)。由極差分析可知，對(duì)菊苣酸含量的影響因素從大到小依次為料液比、提取時(shí)間、提取功率。說明料液比對(duì)菊苣酸含量的影響最大，是主要因素，其次是時(shí)間和功率。提取條件的優(yōu)化組合為A2B3C3。由此確定最佳酶解條件為提取功率300 W、提取時(shí)間660 s和料液比1∶25 g/mL。該優(yōu)化組合在上述9組試驗(yàn)并中出現(xiàn)。在此提取條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出平均菊苣酸含量為158.4 μg/g。

表2　三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results the three factors and three levels orthogonal experiment

3結(jié)論

菊苣酸最佳提取條件為50%乙醇、料液比1∶25 g/mL、微波提取時(shí)間660 s、微波提取功率300 W和提取次數(shù)為1次。在最佳提取條件下進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到菊苣酸平均含量為158.4 μg/g。與傳統(tǒng)提取方法相比，該方法具有簡便、可靠、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。

［1］張瑩，劉珂，吳立軍．紫錐菊屬藥用植物研究進(jìn)展［J］．中草藥，2001，32（9）:852-855

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Study on Extraction Conditions of Ultrasonic Microwave Synergistic Extraction Method of Cichoric Acid

WANG Ying-chao1，WANG Lei2，JIN Hong2，*，LI Qiu-chuang2，YANG Xiao-li2
（1.College of Basic Science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2.College of Agronomy and Resource Environment，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Studing on optimum extraction conditions of cichoric acid from Echinacea purpurea with ultrasonic microwave extraction.Using the fresh Echinacea root，exploring the concentration of ethanol，extraction time，microwave power，ratio of material to liquid and other factors on the content of cichoric acid from Echinacea purpurea，and adopting the optimization extraction conditions by orthogonal test.The results showed that the concentration of 50%ethanol，solid-liquid ratio 1∶25 g/mL，microwave power 300 W，one times extraction and extraction times of 660 s as the best extraction conditions.Three groups of parallel test under the optimum condition were conducted，the average content of cichoric acid was 158.4 μg/g.

Echinacea purpurea；cichoric acid；ultrasonic microwave synergistic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.008

2015-05-04

天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410061092）

王英超（1981—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與研究工作。

金紅（1967—），女，教授，碩士，研究方向：生物化學(xué)教學(xué)與生物技術(shù)研究。