枸杞黃酮對(duì)H2O2致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

曾泰，馬磊，王偉，廖國(guó)玲

（寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，寧夏銀川750004）

枸杞黃酮對(duì)H2O2致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

曾泰，馬磊，王偉，廖國(guó)玲*

（寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，寧夏銀川750004）

研究枸杞黃酮對(duì)過氧化氫（H2O2）損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，H2O2建立HUVEC的損傷模型。試驗(yàn)分正常對(duì)照組、過氧化氫損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組（VitC）、干預(yù)組（枸杞黃酮100、200、400 mg/L預(yù)處理）。用MTT法觀察枸杞黃酮對(duì)H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）的活性，分析其保護(hù)作用機(jī)制。MTT結(jié)果表明H2O2損傷后內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）為38.8%；100、200、400 mg/L枸杞黃酮干預(yù)組IR分別為34.0%、30.7%、25.5%，IR顯著降低，且與枸杞黃酮濃度呈相關(guān)（P＜0.01）；干預(yù)組中H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞的MDA生成減少，SOD活力增加，與枸杞黃酮濃度呈相關(guān)（P＜0.01）。枸杞黃酮的干預(yù)對(duì)H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，且隨枸杞黃酮濃度的增加，保護(hù)作用更強(qiáng)。其機(jī)制可能與枸杞黃酮抑制H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化以及增強(qiáng)其抗氧化作用有關(guān)。

枸杞黃酮；血管內(nèi)皮細(xì)胞；過氧化氫

血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［1］。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂與心血管疾病間的關(guān)系是目前國(guó)際上普遍關(guān)注的研究課題。自由基、活性氧、脂質(zhì)過氧化物、H2O2等均可引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷?？寡趸瘎┳鳛榭山K止自由基產(chǎn)生的一類化學(xué)物質(zhì)，被認(rèn)為在預(yù)防心腦血管疾病及癌癥的發(fā)生扮演著極其重要的作用［2-3］。近年來，從天然產(chǎn)物中尋找抗氧化劑成為新型藥物研究的重要內(nèi)容，黃酮類化合物就是其中之一。魯曉翔研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化作用［4］。而寧夏枸杞是一種馳名中外的名貴中藥材，黃酮類化合物是枸杞屬植物中分布最廣的一類化合物［5］，但是目前對(duì)其抗氧化機(jī)制尚未有過多的研究。因此，我們選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，深入研究枸杞黃酮化合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。本試驗(yàn)通過對(duì)枸杞黃酮抗氧化性能的研究，以期為開發(fā)利用寧夏枸杞及其有效成分提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材與試劑

枸杞由寧夏農(nóng)科院提供，其總黃酮由本研究室分離和純化［6］。新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所，MTT試劑為Sigma公司產(chǎn)品。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其余均為國(guó)產(chǎn)試劑（分析純級(jí)）。

1.1.2儀器

CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Sheldon公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡：日本Olympus公司；酶標(biāo)儀：美國(guó)Me2tertech公司。1.2方法

1.2.1提取物制備

采用80%乙醇，60℃超聲提取，減壓濃縮，經(jīng)HPD-600型大孔樹脂，乙醇洗脫，減壓濃縮后，超純水定容為枸杞黃酮類化合物溶液［7］。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，鋁鹽法測(cè)定總黃酮的濃度為100 mg/mL。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的HUVEC細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，將生長(zhǎng)良好的HUVEC細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化1 min～2 min后，用培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞壁制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周傳代2～3次，實(shí)驗(yàn)過程中采用生長(zhǎng)匯合成單層的內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.3試驗(yàn)分組

正常對(duì)照組：只加相應(yīng)體積培養(yǎng)液；H2O2損傷模型組：在培養(yǎng)液中加入1 000 μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷4h；枸杞黃酮干預(yù)組：預(yù)先在培養(yǎng)液中分別加入終濃度為100、200、400 mg/L枸杞黃酮溶液孵育24 h，再加入1 000 μmol/LH2O2誘導(dǎo)損傷4 h；陽(yáng)性對(duì)照組（VitC）：在培養(yǎng)液中先加入終濃度為20 mg/L的VitC孵育24 h，再加入1 000 μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷4 h。

1.2.4MTT法檢測(cè)HUVEC活力

試驗(yàn)結(jié)果以MTT的OD值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）/對(duì)照組OD×100%。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA和SOD的測(cè)定

按試驗(yàn)分組所述方法處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按MDA、SOD測(cè)定試劑盒說明書上所述的方法，分別檢測(cè)MDA的含量和SOD的活性，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次4個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果與討論

2.1枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

H2O2處理HUVEC后其細(xì)胞活力較正常組HUVEC細(xì)胞活力下降，（P＜0.01）。與H2O2組比較，枸杞黃酮各濃度組可抑制過氧化氫損傷引起的細(xì)胞活性降低，并隨濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，有顯著性差異（P＜0.01）。見表1。

表1　枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響（±s，n=4）Table 1The effects of medlar flavone on HUVEC vitality induced by H2O2

表1　枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響（±s，n=4）Table 1The effects of medlar flavone on HUVEC vitality induced by H2O2

注：☆為H2O2組與正常組比較P＜0.01，△為與H2O2組比較P＜0.01。

組別劑量OD值IR/%正常組00.463±0.003△0.0 H2O2組1 000（μmol/L）0.283±0.002☆38.8 VitC組20（mg/L）0.356±0.002△23.1 H2O2+枸杞黃酮干預(yù)組1100（mg/L）0.306±0.002△34.0 H2O2+枸杞黃酮干預(yù)組2200（mg/L）0.321±0.002△30.7 H2O2+枸杞黃酮干預(yù)組3400（mg/L）0.345±0.002△25.5

2.2枸杞黃酮對(duì)H2O2損傷HUVEC的SOD活性和MDA含量的影響

與正常組比較，H2O2損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)MDA含量增高，SOD活性降低，其差異具有顯著性（P＜0.01）。而枸杞黃酮各濃度干預(yù)組細(xì)胞SOD活性升高，MDA生成減少，其變化程度與枸杞黃酮濃度呈正比，與H2O2損傷組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。見表2。

表2　枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性及MDA含量的影響（±s，n=4）Table 2The effects of medlar flavone on SON and MDA in HUVEC induced by H2O2

表2　枸杞黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性及MDA含量的影響（±s，n=4）Table 2The effects of medlar flavone on SON and MDA in HUVEC induced by H2O2

注：a為損傷組與正常組比較P＜0.01，b為與H2O2組比較P＜0.01。

組別劑量MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）正常組00.418±0.042b18.837±0.456bH2O2組1000（μmol/L）2.216±0.062a13.323±0.320aVitC組20（mg/L）1.304±0.105b17.076±0.063bH2O2+枸杞黃酮干預(yù)組1 100（mg/L）1.796±0.155b15.084±0.569bH2O2+枸杞黃酮干預(yù)組2 200（mg/L）1.674±0.054b16.080±0.328bH2O2+枸杞黃酮干預(yù)組3 400（mg/L）1.427±0.106b16.616±0.313b

3討論

H2O2是體內(nèi)常見的一種活性氧，可促進(jìn)自由基的生成，并直接作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)，造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷［8］。MTT參與活細(xì)胞的能量代謝，可被活細(xì)胞線粒體腺苷三磷酸酶分解，形成藍(lán)紫色結(jié)晶物，而死細(xì)胞無此功能。該藍(lán)紫色結(jié)晶物能被DMSO溶解，在570 nm處有一個(gè)較大吸收峰，在酶標(biāo)儀上可測(cè)定其吸光度值，直接反映活細(xì)胞的數(shù)量和活性［9］。細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映出細(xì)胞損傷的程度。SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的第一道防線，主要清除O2-，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。SOD活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力［10-11］。

本研究表明，H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使內(nèi)皮細(xì)胞的存活率明顯下降，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）為38.8%。預(yù)先加入不同濃度梯度（100、200、400 mg/L）的枸杞黃酮?jiǎng)t可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，降低細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR分別為34.0%、30.7%、25.5%），呈細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的下降與枸杞黃酮化合物的濃度正正比。內(nèi)皮細(xì)胞在H2O2刺激下，與正常對(duì)照組相比，MDA含量明顯增加，細(xì)胞SOD活性顯著降低。加入100、200、400 mg/L枸杞黃酮預(yù)先干預(yù)，與H2O2組相比，MDA含量明顯降低，細(xì)胞SOD活性顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MDA含量的降低說明枸杞黃酮可通過抑制脂質(zhì)過氧化而減輕H2O2造成的細(xì)胞損傷；而枸杞黃酮可顯著升高H2O2損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的SOD活性，提示枸杞黃酮通過增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基的能力來保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘發(fā)的氧化損傷。枸杞黃酮對(duì)H2O2所致的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，且隨著枸杞黃酮?jiǎng)┝康脑黾?，保護(hù)作用效果更好。其保護(hù)作用可能機(jī)制與抑制脂質(zhì)過氧化以及增強(qiáng)抗氧化作用有關(guān)。

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Protective Effect of Medlar Flavones on the Vascular Endothelial Cells Injuried by Hydrogen Peroxide

ZENG Tai，MA Lei，WANG Wei，LIAO Guo-ling*
（College of Inspection，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

To investigate the protective effect of medlar flavonoids on the injury of vascular endothelial cells（VEC）induced by hydrogen peroxide.The endothelial cells strain from human umbilical vein（HUVEC）was cultured and a model of VEC injured by hydrogen peroxide（H2O2）was established.This study was conducted as follows：normal control group，H2O2-injury group（1 000 μmol/L），VitC control group，medlar flavonoids protective groups（100，200，400 mg/L）.Cell viability was tested by using MTT.The levels of malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）were measured with corresponding kits.and analysis its possible mechanisms.MTT result demonstrated that the inhibition ratio of HUVEC was 38.8%under hydrogen peroxide，but the inhibition ratio of medlar flavonoids protective groups were 34.0%，30.7%，25.5%，which were lower than H2O2-injury group.Medlar flavonoids could inhibit the hydrogen peroxide induced VEC reduction，reduced inhibition ratio，the MDA production，and the activity of SOD was increased under hydrogen peroxide.And showed does-dependent manner.These results demonstrated that medlar flavonoids can protect the VECs from H2O2-induced injury，With the increase of the concentration of medlar flavone，stronger protective effect.The possible mechanism may refer to the its effect of anti-lipid peroxidation and SOD activity enhancing.

medlar flavonoids；umbilical vein endothelial cells；H2O2

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.004

2014-05-20

寧夏醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（國(guó)家級(jí)和區(qū)級(jí)201210752004）

曾泰（1991—），男（漢），學(xué)士，研究生在讀，研究方向：臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。

廖國(guó)玲（1967—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：西部特色天然產(chǎn)物和糖尿病血管病變研究。