凝集素PSL通過(guò)下調(diào)HK2抑制前列腺癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)的研究*

西安市兒童醫(yī)院兒科疾病研究所(西安 710002)　吳守振　武海濱　劉　萍

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西安市兒童醫(yī)院兒科疾病研究所(西安 710002)吳守振武海濱劉萍△

張紅▲

目的：研究凝集素PSL對(duì)前列腺癌Warburg效應(yīng)的影響。方法：采用色譜分離純化凝集素PSL，HPLC分析其純度。Real-time PCR 檢測(cè)己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶2(PKM2)和磷酸果糖激酶(PFK)的表達(dá)。MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果：色譜分離純化獲得了純度大于95%的PSL；PSL抑制了前列腺癌細(xì)胞PC3的細(xì)胞活力，降低了HK2的表達(dá)，抑制了PC3細(xì)胞的葡萄糖吸收和乳酸生成。結(jié)論：PSL通過(guò)下調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞HK2的表達(dá)抑制其Warburg效應(yīng)，進(jìn)而抑制了PC3細(xì)胞活力。

代謝異常是腫瘤的重要特征之一，腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下也通過(guò)糖酵解方式獲得能量，而不是通過(guò)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化。這種現(xiàn)象是細(xì)胞惡變過(guò)程中最為基礎(chǔ)的代謝改變之一，被稱為“Warburg效應(yīng)”或者有氧糖酵解[1]。已糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過(guò)程中3個(gè)極為重要的限速酶。

植物凝集素是一類糖結(jié)合特異性非免疫原性蛋白質(zhì)或糖蛋白，廣泛存在于多種植物中。凝集素對(duì)多種細(xì)胞系具有凝血活性，毒性作用，抗增殖活性，抗腫瘤，免疫激活及抗真菌和抗病毒等多種生物學(xué)活性。研究表明：從刀豆種子中提取的一種新型凝集素---伴刀豆球蛋白A (ConA)，具有潛在的抗肝癌作用[2]。駱駝蓬凝集素對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，人類食管癌細(xì)胞(Eca-109) 和人類肝癌細(xì)胞( BEL-7404)等三種細(xì)胞系均具有抑制增殖的活性。其中，對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞的抗增殖活性比較顯著，并可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[3]。

材料與方法

1 研究材料

1.1細(xì)胞： 前列腺癌細(xì)胞PC3購(gòu)自上海細(xì)胞所。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，培養(yǎng)基為含10%的DMEM培養(yǎng)基。

1.2主要試劑及儀器： 抗人HK2、PFK和PKM2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE購(gòu)自Roche公司，Real time PCR相關(guān)試劑及引物購(gòu)自Takara公司。色譜儀為美國(guó)GE公司，HPLC儀器為美國(guó)Waters公司，Real time PCR儀為美國(guó)Life公司。

2 研究方法

2.1PSL的提取、純化： 從新鮮Polygonatum sibiricum Red中采用PBS低溫提取，硫酸銨分級(jí)沉淀粗提取，然后以陽(yáng)離子交換(流動(dòng)相為Tris-Cl，pH 7.0，線性洗脫)和分子篩層析(流動(dòng)相為PBS，pH 7.2)進(jìn)行純化。所得PSL進(jìn)行HPLC鑒定其純度，流動(dòng)相為PBS，pH 7.2。

2.2siRNA 干涉： 將前列腺癌細(xì)胞PC3接種至6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法按X-tremeGENE說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HK2干涉片段和對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪公司。

2.3 細(xì)胞活力： 以3000個(gè)/孔將PC3細(xì)胞接種入細(xì)胞板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以20 μg/ml PSL處理細(xì)胞，分別在24 h，48 h，72 h和96 h檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，在每孔細(xì)胞中加入100μl新鮮培養(yǎng)基。并將培養(yǎng)基另外加入4個(gè)孔，作為調(diào)零孔。加入10 μl MTT試劑，盡量保證加入均勻，無(wú)氣泡產(chǎn)生。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃，5%CO2孵育1 h。4 h后，加DMSO，溶解10 min。將96孔板放入96孔微板酶標(biāo)儀讀數(shù)，參數(shù)設(shè)定：吸收波長(zhǎng)440 nm，參考波長(zhǎng)660 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4葡萄糖消耗： 1×105個(gè)/孔PC3細(xì)胞接種到6孔板，加入20 μg/ml PSL處理24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)足體積至2 ml，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行48 h培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2。將培養(yǎng)液收集到1.5 ml EP管中，以初始細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖量作為空白。按1∶200比例配制反應(yīng)液，并設(shè)置空白和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。將反應(yīng)液混勻后在37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，以酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5乳酸生成： 1×105個(gè)/孔PC3細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板，加入20 μg/ml PSL處理24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)足體積至2 ml，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行48 h培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2。將培養(yǎng)液收集到1.5 ml EP管中，以初始細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸量作為空白。按樣本 0.02 ml，酶工作液 1 ml，顯色液 0.2 ml比例配制反應(yīng)液，并設(shè)置空白和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。將反應(yīng)液混勻后在37℃水浴反應(yīng)10 min后，加入終止液2 ml，按100 μl/孔加入96孔板，以酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot： 收集各種處理的細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，充分裂解。BCA法進(jìn)行蛋白定量，取60 μg 處理好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，120V恒壓轉(zhuǎn)移2 h，2% BSA室溫封閉30 min，將NC膜與待檢測(cè)的一抗室溫孵育1 h；PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min。用ECL發(fā)光試劑盒處理NC膜，發(fā)光顯影。

2.7Real time PCR： 從處理的PC3細(xì)胞中提取RNA，定量后，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行Real time PCR，反應(yīng)混合液為44 μl、Tag聚合酶1 μl，反應(yīng)終體積為50 μl。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2 min，然后93℃ 40 S，60℃ 35s，72℃ 30s共40個(gè)循環(huán)。以β-actin進(jìn)行量化。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)　果

1 PSL的提取、純化和鑒定從Polygonatum sibiricum Red我們粗提了PSL，經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換(見(jiàn)附圖A)和分子篩層析(見(jiàn)附圖B)兩步層析方法進(jìn)一步純化，SDS-PAGE初步鑒定(見(jiàn)附圖C)，Western blot 結(jié)果表明純化的PSL能夠與其抗體特異性結(jié)合(見(jiàn)附圖D)，HPLC檢測(cè)純化的PSL的純度為97%(見(jiàn)附圖E)。

附圖PSL純化鑒定結(jié)果[A:陽(yáng)離子層析結(jié)果(箭頭為PSL峰)；B:分子篩層析結(jié)果(箭頭為PSL峰)；C:SDS-PAGE結(jié)果(箭頭為PSL)；D:免疫印跡分析結(jié)果；E:HPLC分析結(jié)果]

2 PSL抑制了前列腺癌細(xì)胞PC3的Warburg效應(yīng)我們分析了PSL對(duì)前列腺癌細(xì)胞的代謝影響，結(jié)果表明PSL明顯抑制了PC3細(xì)胞的葡萄糖吸收減少了1.76±0.18倍。PSL降低了PC3細(xì)胞降低2.43±0.25倍乳糖生成，提示PSL抑制了前列腺癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)。

3PSL下調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC3的HK2表達(dá)我們觀察了PSL對(duì)Warburg效應(yīng)三個(gè)關(guān)鍵的限速酶表達(dá)的影響，Western blot和Real-time PCR結(jié)果表明PSL提高了PC3細(xì)胞中HK2的表達(dá)，而對(duì)PFK和PKM2的表達(dá)沒(méi)有影響(P>0.05)。

4 PSL抑制了前列腺癌細(xì)胞PC3的細(xì)胞活力 我們檢測(cè)了PSL對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力的影響，PSL降低了PC3細(xì)胞活力。以siRNA抑制HK2的表達(dá)時(shí)，PSL對(duì)PC3細(xì)胞活力的抑制無(wú)影響(P>0.05)。

討　論

Polygonatum sibiricum Red和Polygonatum cyrtonema Hua為同科不同種植物。研究表明：Polygonatum cyrtonema Hua凝集素(PCL)對(duì)多種癌細(xì)胞具有顯著的抗增殖和凋亡誘導(dǎo)活性。PCL能誘導(dǎo)鼠纖維肉瘤L929 細(xì)胞凋亡，其糖結(jié)合特異性和凋亡誘導(dǎo)活性之間存在一種緊密的關(guān)系，這種凝集素誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制與半胱天冬酶(Caspase)依賴途徑[4]和抑制 Ras/Raf 自救或抗凋亡途徑相關(guān)[5]。但是，Polygonatum sibiricum Red凝集素在腫瘤中的作用和機(jī)制還尚不清楚。

本研究對(duì)PSL前列腺癌細(xì)胞的增殖及代謝中的作用作了研究，初步探討了其機(jī)制。我們首先提取制備了PSL，從Polygonatum sibiricum Red中，采用硫酸銨分級(jí)沉淀粗提了PSL，進(jìn)一步利用兩步層析(陽(yáng)離子層析和分子篩層析)，我們制備了純度大于95%的PSL，制備的PSL能夠與其抗體特異性結(jié)合。本研究我們制備的PSL純度較高，制備方法簡(jiǎn)單。

Warburg效應(yīng)是腫瘤代謝異常的主要表現(xiàn)形式，為腫瘤的生長(zhǎng)提供能量、代謝物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其中，葡萄糖的極大吸收和乳酸生成是腫瘤Warburg效應(yīng)的重要特征[6]。前列腺癌是男性生殖泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[7]，隨著我國(guó)人口老齡化和生活方式的改變，前列腺癌發(fā)病率明顯增高。更為重要的是，大部分前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期[8]。本研究中，我們觀察了PSL對(duì)前列腺癌代謝的影響。我們的研究結(jié)果顯示PSL能夠明顯抑制PC3細(xì)胞的葡萄糖吸收和乳酸生成，提示PSL改變了前列腺癌的代謝異常。進(jìn)一步，我們檢測(cè)了PSL對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力的影響，正如我們預(yù)期的，PSL明顯抑制了前列腺癌的細(xì)胞活力，抑制了其生長(zhǎng)，這些研究結(jié)果表明：PSL通過(guò)抑制前列腺癌Warburg效應(yīng)而抑制腫瘤生長(zhǎng)，為PSL在腫瘤中的作用提高依據(jù)。

已糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PKM)是糖酵解過(guò)程中3個(gè)極為重要的限速酶。其中，HK2是腫瘤Warburg效應(yīng)中的第一個(gè)限速酶，是腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[9]。HK2在許多腫瘤組織中表達(dá)的量及活性增加明顯增高，當(dāng)病灶發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，表達(dá)更高[10]，HK2在前列腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于良性前列腺增生及正常前列腺組織[11]。本研究中，我們檢測(cè)了PSL對(duì)Warburg效應(yīng)3個(gè)限速酶的影響。我們發(fā)現(xiàn)：PSL抑制了前列腺癌PC3細(xì)胞HK2的表達(dá)，而對(duì)PFK和PKM2的表達(dá)沒(méi)用影響，表明PSL是通過(guò)下調(diào)HK2的表達(dá)抑制了前列腺癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)以siRNA干涉HK2的表達(dá)時(shí)，PSL對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力的抑制能力消失。

總之，通過(guò)本研究，我們制備了純度較高的PSL，觀察了其對(duì)前列腺癌Warburg效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)PSL能夠通過(guò)下調(diào)HK2的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞活力，提示PSL可能是前列腺癌較好的一個(gè)治療藥物。

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(收稿：2015-04-30)

陜西省中醫(yī)藥研究院

R737.25

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.007

* 陜西省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(S2012ZY241)

△ 陜西中醫(yī)藥大學(xué)

主題詞 前列腺腫瘤/藥理學(xué)前列腺腫瘤/血液