特應(yīng)性皮炎患兒外周血CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

陳仕勝 喻蘇婷 周鵬飛 金宛宛 馬新華 張小婷 高 宇

特應(yīng)性皮炎患兒外周血CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

陳仕勝 喻蘇婷 周鵬飛 金宛宛 馬新華 張小婷 高 宇

目的： 確定特應(yīng)性皮炎（AD）患兒外周血CD4+T細(xì)胞中miR-155的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。方法： 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time-PCR）檢測(cè)45例AD患兒和38例健康者對(duì)照外周血CD4+T細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清IL-5和IFN-γ表達(dá)，并進(jìn)行SCORAD評(píng)分。結(jié)果： AD組miR-155的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；AD患者組miR-155的表達(dá)與SCORAD評(píng)分、血清IL-5表達(dá)水平呈正相關(guān)（均P＜0.05），與血清IFN-γ表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論： AD患兒外周血CD4+T細(xì)胞中miR-155表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)，可作為評(píng)定AD嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。

兒童； 特應(yīng)性皮炎； miR-155

特應(yīng)性皮炎是一種慢性炎癥性皮膚病，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制是遺傳因素背景下由過(guò)敏原誘發(fā)的IgE介導(dǎo)的皮膚速發(fā)型和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。Th1/Th2失衡在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。1microRNA（miRNA）參與許多炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展。2，3近年來(lái)發(fā)現(xiàn)miRNA在銀屑病和AD皮損中異常表達(dá)，其中miRNA-155在AD中呈特異性高表達(dá)，說(shuō)明miRNA-155可能參與AD的免疫反應(yīng)調(diào)控。4然而AD患者PBMCs中是否存在miRNA-155的高表達(dá)，及其與AD嚴(yán)重程度的關(guān)系，目前還不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)特應(yīng)性皮炎患兒外周血CD4+T細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，并與特應(yīng)性皮炎患兒SCORAD評(píng)分、血清IL-5和IFN-γ表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探討miR-155在AD發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 45例AD患兒，符合Hanifin&Rajka AD診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：病程1年以上，每年緩解期＜3個(gè)月者；未發(fā)現(xiàn)其他皮膚病和內(nèi)臟疾病史；停用抗組胺藥1周以上；停用系統(tǒng)及局部糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑1個(gè)月以上。對(duì)照組38例，均來(lái)自我院健康體檢中心，無(wú)自身免疫性皮膚病或內(nèi)臟病史，否認(rèn)家族過(guò)敏史。所有受試兒童法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2主要試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司），miRNA提取試劑盒（美國(guó)Sigma公司），RTPCR試劑盒（美國(guó)Promega公司），miR-155引物（美國(guó)Invitrogen公司），IL-5 ELISA kit、IFN-γELISA kit（美國(guó)R&D systems公司）MACS分選儀（德國(guó)Miltenyi Biotec公司），F(xiàn)CX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀（Bio-Rad公司），流式細(xì)胞分析儀（COULTER Epics XL·MCL，美國(guó)）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3研究方法

1.3.1所有患兒由經(jīng)過(guò)SCORAD課程專門培訓(xùn)的一名指定醫(yī)生評(píng)價(jià)。參照文獻(xiàn)5將AD患兒按照SCORAD評(píng)分＜15分為輕度，15～40分為中度，＞40分為重度3組。

1.3.2標(biāo)本收集及外周血CD4+T細(xì)胞的分離 采集病例組和健康對(duì)照組外周血10mL，分成兩管，每管5 mL，EDTA-K2抗凝，于-20℃存放備用。取其中一管用淋巴細(xì)胞分離液分離外周單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞。流式細(xì)胞儀最后檢測(cè)CD4+T細(xì)胞純度。

1.3.3總RNA提取與cDNA合成 采用RNA提取試劑盒從上述CD4+T細(xì)胞中提取總RNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定RNA的完整性，紫外分光光度儀測(cè)定吸光度（A260/280）值。取RNA1μg，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，PolyA聚合酶1μL，5xRT緩沖液4μL，加無(wú)RNA酶水補(bǔ)足體積至25μL，于PCR儀42℃ 1h，90℃ 10min。將合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4Real-timePCR 引物（miR-155，內(nèi)參U6）由美國(guó)Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系（總體積20 μL）：SYBRGreenmix10μL，特異性引物2μL，通用引物2μL，cDNA2μL，ddH2O4μL。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10min；95℃ 10s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線分析。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔCt法分析，選擇U6基因表達(dá)量值作為內(nèi)參照。將同一樣本目的基因的Ct值分別減去其相應(yīng)的U6的Ct值，獲得ΔCt值，最后計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量2-ΔCt。

1.3.5取上述外周血另一管標(biāo)本，使用IL-5、IFN-γ ELISAkit，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，讀取血清樣本的吸光度值（A），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，miR-155相對(duì)表達(dá)量用ˉx±s表示。獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析；相關(guān)性分析，雙變量正態(tài)分布資料計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)，不符合雙變量正態(tài)分布資料，計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AD患者與健康對(duì)照組的相關(guān)數(shù)據(jù)情況 45例AD患兒，其中男23例，女22例，年齡6.3～12.0歲，平均8.8±3.2歲。根據(jù)SCORAD評(píng)分，將其分為輕、中、重度3組（＜15分為輕度，15～40分為中度，＞40分為重度）。對(duì)照組38例，其中男21例，女17例，年齡6.0～12.0歲，平均9.0±1.8歲，對(duì)照組和AD患兒組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AD組血清IL-5的量高于對(duì)照組，而IFN-γ的表達(dá)低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AD患者組miR-155在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)均高于健康對(duì)照組（P＜0.05），且AD患者中、重度組miR-155的表達(dá)水平均高于輕度組（P＜0.05）；中度組與高度組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2AD患兒CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)水平與血清IL-5、IFN-γ表達(dá)水平、皮炎嚴(yán)重程度SCORAD評(píng)分相關(guān)性分析 AD組患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)水平與皮炎嚴(yán)重程度SCORAD評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.529，P＜0.05），與血清IL-5的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.459，P＜0.05），與血清中IFN-γ表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.310，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

表1　對(duì)照組和AD輕、中、重度組miR-155、IL-5、IFN-γ的表達(dá)

圖1　AD患者CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)與SCORAD、血清IL-5、IFN-γ表達(dá)相關(guān)性分析

3　討論

近年來(lái)研究顯示在異常免疫反應(yīng)中miR-155高表達(dá)。在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、多發(fā)性硬化（MS）中miR-155表達(dá)異常，一些過(guò)敏性疾病如過(guò)敏性哮喘患者中也能發(fā)現(xiàn) miR-155的表達(dá)異常。6自 2007年Sonkoly等發(fā)現(xiàn)miRNA在銀屑病、AD皮損中異常表達(dá)以來(lái)，miRNA在皮膚病方面的研究越來(lái)越多。4研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在AD皮損浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中呈特異性高表達(dá)，主要是CD4+T細(xì)胞高表達(dá)。伴隨著T細(xì)胞分化、活化miRNA-155的表達(dá)顯著升高。上調(diào)表達(dá)的miRNA-155通過(guò)結(jié)合細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4，CTLA-4）的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）而抑制CTLA-4，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能。7

本課題組通過(guò)檢測(cè)45例6歲以上AD患兒外周血CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，不同嚴(yán)重程度的AD患者外周血CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)有不同程度的升高，與Sonkoly等7的發(fā)現(xiàn)一致。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)水平與皮損嚴(yán)重程度評(píng)分（SCORAD）呈正相關(guān)。Th細(xì)胞亞群的失衡在AD的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，目前認(rèn)為Th2介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)是AD的主要發(fā)病機(jī)制。關(guān)于miR-155在Th分化中的研究是近幾年的熱點(diǎn)之一，8我們分別檢測(cè)AD患兒Th1、Th2的標(biāo)志性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-5，發(fā)現(xiàn)AD患者以Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，這與傳統(tǒng)觀點(diǎn)一致。既往體外研究顯示miR-155以IFN-γ受體為靶點(diǎn)抑制IFN-γ反應(yīng)，從而使CD4+細(xì)胞向Th1分化。9我們進(jìn)一步將miR-155的表達(dá)與IL-5、IFN-γ進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達(dá)與IL-5的量呈正相關(guān)，而與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)。我們推測(cè)AD患者體內(nèi)Th1/Th2的狀態(tài)存在動(dòng)態(tài)變化。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎患兒外周血CD4+T細(xì)胞miR-155的表達(dá)升高，且隨皮損嚴(yán)重程度加重，表達(dá)量增高。miR-155可以作為評(píng)定AD嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。

1CarmiLI，HomeyB，SoumelisV.Amodularviewofcytokine networksinatopicdermatitis.ClinRevAllergyImmunol，2011，41（3）：245-253.

2HaTY.TheroleofmicroRNAsinregulatoryTcellsandtheimmuneresponse.ImmuneNetwork，2011，11：11-41.

3文韻詩(shī)，秦海紅，徐金華.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞中miR-17和miR-20a的表達(dá)及與病情活動(dòng)的相關(guān)性研究.中華皮膚科雜志，2014，47（3）：172-175.

4SonkolyE，WeiT，JamonPC，etal.MicroRNAs：Novelregulatorsinvolvedinthepathogenesisofpsoriasis？PLoSOne，2007，2（7）：e610.

5KunzB，OranjeAP，LabrèzeL，etal.Clinicalvalidationand guidelinesfortheSCORADindex：consensusreportoftheeuropeantaskforceonatopicdermatitis.Dermatology，1997，195（1）：10-19.

6VigoritoE，KohlhaasS，LuD，etal.MiR-155：anancientregulatoroftheimmunesystem.ImmunolRev，2013，253（1）：146-157.

7SonkolyE，JansonP，MajuriML，etal.MiR-155isoverexpressedinpatientswithatopicdermatitisandmodulatesT-cell proliferativeresponsesbytargetingcytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4.JAllergyClinImmunol，2010，126（3）：581-589.

8JiaS，ZhaiH，ZhaoM.MicroRNAsregulateimmunesystemvia multipletargets.DiscovMed，2014，18（100）：237-247.

9ArnobB，F(xiàn)elixS，CaitlinS，etal.Micro-RNA-155inhibits IFN-γsignalinginCD4+Tcells.EurJImmunol，2010，40（1）：225-231.

（收稿：2015-04-29 修回：2015-07-22）

Correlation ofm iR-155 in peripheralblood CD4+T cells from children with atopic dermatitiswith disease severity

CHEN Shi-sheng，YU Su-ting，ZHOU Peng-fei，et al.Department ofDermatology，Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou，325000

Objective：To determ ine the correlation ofmiR-155 in the peripheral blood CD4+T cells from children with atopic dermatitis（AD）with disease severity.M ethods：The expression levels ofmiR-155 of 45 children with AD and 38 healthy controlswere detected by Real time-PCR.The levels of serum IL-5 and IFN -γwere tested by ELISA.SCORAD of the patientswere assessed.Resu lts：The expression level ofmiR-155 of children with AD was higher than that in healthy controls（P＜0.05）.The expression level ofmiR-155 was positively correlated with the SCORAD and serum IL-5 level（P＜0.05）and negatively correlated with serum IFN-γ（P＜0.05）.Conclusion：miR-155 is positively correlated with the disease severity in children with AD，which can be used for amarker of disease severity in AD.

children；atopic dermatitis；miR-155

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江溫州，325000