響應(yīng)面法優(yōu)化樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾

路瑞秋，胡永丹，張薄博，許贛榮*

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫　214122）

響應(yīng)面法優(yōu)化樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾

路瑞秋，胡永丹，張薄博，許贛榮*

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫214122）

以樟芝菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物安卓奎諾爾為目標(biāo)物，采用Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：接種量為296.80 mL/kg、Triton X-100添加量為1.10 mL/kg、輔酶Q0的添加量為0.23 g/kg時，理論上樟芝固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基安卓奎諾爾產(chǎn)量的最大值為865.85 mg/kg。經(jīng)驗證，安卓奎諾爾實(shí)際產(chǎn)量為865.32 mg/kg，表明實(shí)驗建立的模型能較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的情況。通過優(yōu)化，樟芝固態(tài)發(fā)酵安卓奎諾爾產(chǎn)量比優(yōu)化前（260.57 mg/kg）提高了232.09%。

樟芝；固態(tài)發(fā)酵；安卓奎諾爾；響應(yīng)面

牛樟芝又名牛樟菇、血靈芝等，屬于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、多年生蕈菌類，是1995年才確定的一個新種［1］。至2012年從牛樟芝中已分離得到的化合物約225 種，這些化合物包括大分子化合物蛋白、核酸、多糖等，小分子化合物木質(zhì)素、芳香化合物、泛醌類［2］、馬來酸和琥珀酸衍生物［3］等。研究表明，樟芝的活性產(chǎn)物具有保肝護(hù)肝、抗癌、抗氧化、消炎等功效［4-7］。

樟芝僅生于臺灣深山特有的“國寶”級樹種——百年以上的牛樟樹上，且樟芝生長極為緩慢，形成子實(shí)體的時間相當(dāng)長［8］，野生樟芝在市場上供不應(yīng)求，每公斤野生樟芝子實(shí)體價格均在萬元以上，面對這種情況，通過人工培養(yǎng)的方法得到樟芝勢在必行。目前，樟芝的人工培養(yǎng)方法主要有3 種方式：椴木栽培法、液態(tài)培養(yǎng)法、固態(tài)培養(yǎng)法。而固態(tài)培養(yǎng)法以其得到的產(chǎn)物中活性成分與野生樟芝子實(shí)體活性成分的近似程度較高，且與培養(yǎng)子實(shí)體相比發(fā)酵周期較短，生產(chǎn)原料不受限制等優(yōu)勢得到大范圍推廣。

2007年，Lee等［2］用正己烷萃取樟芝產(chǎn)物，得到一個新化合物安卓奎諾爾（antroquinonol），屬于泛醌類化合物。研究表明，安卓奎諾爾對胰腺癌、肝癌具有顯著的抑制作用［9-11］。Kumar等［12］研究顯示，安卓奎諾爾可以顯著地抑制3 種非小細(xì)胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLS）癌細(xì)胞的增殖。目前已進(jìn)入美國食品藥品管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）二期實(shí)驗［13］，是具有優(yōu)良前景的抗癌化合物。

目前，國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于安卓奎諾爾方面的研究多集中在其藥理活性等方面，對通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和代謝調(diào)控來提高樟芝菌發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾產(chǎn)量的報道極少，喻學(xué)淳等［14］對樟芝菌產(chǎn)安卓奎諾爾的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，Hu Yongdan等［15］對樟芝菌液態(tài)發(fā)酵安卓奎諾爾的機(jī)理進(jìn)行了研究。本研究主要通過對樟芝菌體的細(xì)胞通透性和代謝的調(diào)控［16-18］進(jìn)行研究，以提高固態(tài)發(fā)酵安卓奎諾爾的產(chǎn)量，并利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化上述條件。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樟芝菌上海福茂食品有限公司；谷物原料（粳米、秈米、糯米）市售。

NH4Cl、KH2PO4、MgSO4、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑；乙腈、甲醇（色譜純）德國Meker公司。

1.2儀器與設(shè)備

DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽上海?，攲?shí)驗設(shè)備有限公司；PL602-S電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）美國Waters公司；Sepax Amethyst C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，3 μm） 美國賽飛公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

樟芝接種于PDA斜面，28 ℃避光培養(yǎng)9 d，于4 ℃保藏。

孢子懸浮液制備：取PDA斜面，加無菌水，并用接種棒將斜面表層孢子刮下，對孢子數(shù)進(jìn)行鏡檢，孢子數(shù)達(dá)到1×106個/mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、黃豆粉7 g/L。種子液在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)4 d。

固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：谷物原料100 g、NH4Cl 0.04 g、KH2PO40.025 g、MgSO40.025 g，初始含水量 50 g水/g干基，接種量300 mL/kg干基，28 ℃培養(yǎng)24 d。

所有培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌20 min。

1.3.2安卓奎諾爾的分析檢測方法

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定樟芝產(chǎn)品中安卓奎諾爾產(chǎn)量。取樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末3 g，加入無水乙醇75 mL，在35 ℃的DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽內(nèi)振蕩提取85 min，靜置后0.22 μm微膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，具體分析條件如文獻(xiàn)［19］所示。

安卓奎諾爾參標(biāo)由本實(shí)驗室自行制備［20-21］，經(jīng)過紫外（ultraviolet，UV）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、HPLC分析，其純度≥91%。

1.3.3產(chǎn)品收率的測定

將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物取出，45 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量并測定水分含量。產(chǎn)品收率按下式計算。

1.3.4樟芝固態(tài)發(fā)酵條件的研究

1.3.4.1谷物原料對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾影響的測定

分別稱取粳米、秈米、糯米各100 g放于1 L錐形瓶內(nèi)，接入30 mL的種子液，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 d后烘干磨粉測定安卓奎諾爾產(chǎn)量。根據(jù)安卓奎諾爾產(chǎn)量的大小確定最佳的發(fā)酵基質(zhì)。

1.3.4.2接種量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響測定

將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（谷物原料為粳米）放于1 L茄子瓶中，分別接入100.00、200.00、300.00、400.00、500.00 mL/kg干基的種子液，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 d后烘干磨粉測定安卓奎諾爾產(chǎn)量。根據(jù)安卓奎諾爾產(chǎn)量和收率的大小確定最佳的接種量。

1.3.4.3Triton X-100的添加對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾影響的測定

通過前期實(shí)驗證實(shí)添加表面活性劑Triton X-100［22-23］可以促進(jìn)安卓奎諾爾的產(chǎn)生，將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（谷物原料為粳米）放于1 L茄子瓶中，接入200 mL/kg干基的種子液，發(fā)酵16 d進(jìn)行28～25 ℃的變溫調(diào)控，發(fā)酵18 d分別添加Triton X-100 0.20、0.60、1.00、1.40 mL/kg，發(fā)酵30 d結(jié)束，烘干磨粉測定安卓奎諾爾產(chǎn)量。根據(jù)安卓奎諾爾產(chǎn)量和收率的大小確定Triton X-100的最適添加量。

1.3.4.4輔酶Q0的添加對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾影響的測定

通過前期實(shí)驗證實(shí)添加輔酶Q0可以促進(jìn)安卓奎諾爾的產(chǎn)生，將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（谷物原料為粳米）放于1 L茄子瓶中，接入200 mL/kg干基的種子液，發(fā)酵16 d進(jìn)行28～25 ℃的變溫調(diào)控，于發(fā)酵18 d分別添加Triton X-100 1.00 mL/kg，發(fā)酵20 d分別添加輔酶Q00.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/kg，發(fā)酵30 d結(jié)束，烘干磨粉測定安卓奎諾爾產(chǎn)量。根據(jù)安卓奎諾爾產(chǎn)量和收率的大小確定安卓奎諾爾的最適添加量。

1.3.5響應(yīng)面試驗設(shè)計

綜合單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件，采用Box-Behnken原理建立數(shù)學(xué)模型，以接種量（A）、Triton X-100添加量（B）、輔酶Q0添加量（C）為自變量，以安卓奎諾爾產(chǎn)量（Y）為因變量共設(shè)立了17 個處理組進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

2　結(jié)果與分析

2.1樟芝固態(tài)發(fā)酵基本條件的研究

2.1.1谷物原料的篩選

圖1　不同谷物原料對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響Fig.1　Effect of cereal substrates on antroquinonol production byA. camphorata in solid-state fermentation

固態(tài)發(fā)酵中，發(fā)酵基質(zhì)作為菌體生長的附著物，為發(fā)酵提供主要的碳源及復(fù)雜的生長因子，影響著微生物的生長代謝，因此固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選對于產(chǎn)物的合成和積累有著非常重要的作用，大米作為樟芝固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)有一定的優(yōu)勢，但大米的種類較多，每種大米對樟芝發(fā)酵的影響不盡相同，因此本實(shí)驗考察了三類大米對樟芝菌生長和安卓奎諾爾合成的影響。如圖1所示，以三類大米為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行樟芝固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵干基中安卓奎諾爾產(chǎn)量依次為：粳米＞秈米＞糯米。固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)對樟芝次級代謝產(chǎn)物安卓奎諾爾的合成和積累有重要影響，樟芝菌可以在實(shí)驗所選取的谷物基質(zhì)上生長，但是生長狀況有較大差異。粳米可以良好地支持樟芝菌生長，菌體生長較快，安卓奎諾爾積累量明顯高于其他兩類米；同樣的含水量下秈米比較干硬，樟芝菌生長較為緩慢，不利于安卓奎諾爾的合成和積累；糯米由于黏性較大，致使發(fā)酵基質(zhì)的通氣性差，不利于樟芝菌體的生長，因此安卓奎諾爾的產(chǎn)量也較低。

2.1.2接種量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響

圖2　接種量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響Fig.2　Effect of inoculum amount on antroquinonol production byA. camphorata in solid-state fermentation

發(fā)酵過程中，接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期［24］，接種量小時，菌體的延遲期延長，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長，易染菌；接種量大時，由于接種的時候不僅帶入種子，還有培養(yǎng)液，而種子液中含有一些水解酶，有利于對基質(zhì)的利用，可以縮短生長延遲期，減少污染機(jī)會，但接種量過高往往又會使菌體生長過快，菌體間競爭加大，反而會抑制后期代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以接種量的大小對樟芝固態(tài)發(fā)酵有著重要的影響。如圖2所示，隨著接種量的增加，安卓奎諾爾產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，產(chǎn)品收率呈現(xiàn)下降趨勢但下降不明顯，結(jié)合安卓奎諾爾產(chǎn)量和產(chǎn)品收率兩者來看選取接種量200.00 mL/kg作為樟芝固態(tài)發(fā)酵的最適接種量。

2.1.3Triton X-100添加量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響

發(fā)酵過程中，當(dāng)胞內(nèi)產(chǎn)物高濃度積累時可能會引起產(chǎn)物抑制阻礙活性產(chǎn)物產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，因此，考慮篩選合適的表面活性劑對樟芝細(xì)胞的通透性進(jìn)行調(diào)節(jié)，希望可以進(jìn)一步提高安卓奎諾爾產(chǎn)量的同時保持較高的產(chǎn)品收率。

表1　Triton X-100的添加量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響Table 1 Effect of Triton X-100 concentration on antroquinonolproduction by A. camphorata in solid-state fermentation

如表1所示，隨著Triton X-100添加量的增加，安卓奎諾爾產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)Triton X-100的添加量為1.00 mL/kg時，安卓奎諾爾產(chǎn)量達(dá)到最高，為685.30 mg/kg。隨著Triton X-100添加量的增加，產(chǎn)品收率呈現(xiàn)上升趨勢，原因可能是Triton X-100的添加利于樟芝菌絲體生長的同時加速了安卓奎諾爾的分泌，從而實(shí)現(xiàn)了提高安卓奎諾爾產(chǎn)量的同時保持較高的產(chǎn)物的收率。

2.1.4輔酶Q0添加量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響

圖3　輔酶QQ0的添加對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響Fig.3　Effect of coenzyme Q0concentration on antroquinonol production by A. camphorata in solid-state fermentation

微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量可以通過添加前體物質(zhì)來促進(jìn)合成［25-26］。但是目前有關(guān)安卓奎諾爾合成途徑方面的文獻(xiàn)極少，想要找到安卓奎諾爾合成的前體物質(zhì)需從與安卓奎諾爾結(jié)構(gòu)相似物的合成途徑中尋找，安卓奎諾爾屬于泛醌類化合物［25］，其分子結(jié)構(gòu)式與輔酶Q10極為相似，而輔酶Q0是輔酶Q10的前體物質(zhì)，因此實(shí)驗選擇輔酶Q0作為前體物研究其對安卓奎諾爾合成的影響。如圖3所示，添加輔酶Q0可以促進(jìn)安卓奎諾爾的產(chǎn)生，隨著輔酶Q0添加量的增加，安卓奎諾爾產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而產(chǎn)品的收率變化不明顯，當(dāng)輔酶Q0的添加量達(dá)到0.20 g/kg時，安卓奎諾爾產(chǎn)量達(dá)到834.62 mg/kg，產(chǎn)品收率為39.5%，因此最后確定輔酶Q0的最適添加量為0.20 g/kg。

2.2響應(yīng)面法分析

2.2.1響應(yīng)面試驗結(jié)果

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental values of antroquinonol production

表3　回歸方程方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression equation with antroquinonol yield as a function n

由Box-Behnken原理設(shè)計方案所得的試驗結(jié)果見表2。選取接種量、Triton X-100添加量、輔酶Q0添加量為自變量，以安卓奎諾爾產(chǎn)量為應(yīng)變量，通過Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，獲得樟芝固態(tài)發(fā)酵安卓奎諾爾產(chǎn)量對接種量、Triton X-100、輔酶Q0的二次多項式回歸方程為：Y=877.02+7.66A-6.56B+ 5.07C+10.96AB+14.00AC-3.97BC-22.83A2-30.02B2-31.71C2。

該二次項方程及各項方差分析如表3所示。模型F值為42.99，P＜0.000 1，說明模型高度顯著。此模型相關(guān)系數(shù)R2=0.982 2，表明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測值和實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于樟芝安卓奎諾爾產(chǎn)量的理論預(yù)測。由表3可知，二次項B2、C2對樟芝發(fā)酵安卓奎諾爾有高度顯著的影響（P＜0.000 1）；因素A、A2、AB、AC對樟芝發(fā)酵安卓奎諾爾影響極顯著（P＜0.01）；一次項B、C對樟芝發(fā)酵安卓奎諾爾有顯著影響（P＜0.05）；其他變量的影響均不顯著（P＞0.05）。表明模型中失擬項P＜0.000 1，說明由噪音引起模型偏差的概率P＜0.000 1，模型失擬項顯著。

2.2.2顯著影響因素的交互作用分析

圖4　各兩因素交互作用對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響Fig.4　Response surface plots for the effects of culture conditions on antroquinonol production by A. camphorata

經(jīng)Design-Expert軟件分析可得到3 個顯著影響因素之間的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖4。響應(yīng)面分析圖譜表示兩組獨(dú)立變量對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的影響。由圖4可知，接種量和Triton X-100的交互影響及接種量和輔酶Q0的交互影響對樟芝發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾均有較顯著的影響。

2.3樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾最優(yōu)培養(yǎng)基配方的獲取與驗證

對模型回歸方程進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為接種量296.80 mL/kg、Triton X-100添加量1.10 mL/kg、輔酶Q0添加量0.23 g/kg時，理論上樟芝固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基安卓奎諾爾產(chǎn)量的最大值為865.85 mg/kg。由于以上最佳條件未包括在響應(yīng)面優(yōu)化的17 組試驗中，需進(jìn)一步驗證。為了操作方便，將以上條件修正為接種量為300.00 mL/kg（干基）、Triton X-100添加量為1.00 mL/kg、輔酶Q0添加量為0.23 g/kg。驗證實(shí)驗結(jié)果表明，在最佳發(fā)酵條件為將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基放于1 L茄子瓶中，接入20 mL的種子液，發(fā)酵16 d進(jìn)行28～25 ℃的變溫調(diào)控，于發(fā)酵18 d分別添加Triton X-100 1.00 mL/kg，發(fā)酵20 d添加輔酶Q00.23 g，發(fā)酵30 d結(jié)束，樟芝發(fā)酵安卓奎諾爾的產(chǎn)量達(dá)到865.32 mg/kg，與預(yù)測值相差不大，說明該方程與實(shí)際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗對樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果顯示，統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化策略能非常有效地優(yōu)化調(diào)控樟芝固態(tài)發(fā)酵過程中活性代謝產(chǎn)物。接種量、Triton X-100和輔酶Q0添加量對安卓奎諾爾的產(chǎn)量影響顯著，在接種量為296.80 mL/kg、Triton X-100添加量為1.10 mL/kg、輔酶Q0的添加量為0.23 g/kg時，安卓奎諾爾產(chǎn)量的最大值為865.85 mg/kg。通過實(shí)驗驗證樟芝固態(tài)發(fā)酵安卓奎諾爾的產(chǎn)量為865.32 mg/kg，比優(yōu)化前（260.57 mg/kg）的提高了232.09%。

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Optimization of Antroquinonol Production in Solid-State Fermentation of Antrodia camphorata Using Response Surface Methodology

LU Ruiqiu， HU Yongdan， ZHANG Bobo， XU Ganrong*
（Key Laboratory of Industry and Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi214122， China）

In this study， response surface methodology based on Box-Behnken design was used to optimize the culture conditions for the production of the bioactive metabolite antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodia camphorata. The optimal culture conditions were determined as inoculum amount of 296.80 mg/kg， Triton X-100 concentration of 1.10 mL/kg and coenzyme Q0concentration of 0.23 g/kg. Under these conditions， the maximum predicted yield of antroquinonol was 865.85 mg/kg， which was in good agreement with the experimental value of 865.32 mg/kg. Therefore， the established model could be used for predicting the culture conditions of Antrodia camphorate for antroquinonol production. After optimization， the yield of antroquinonol was increased 232.09% when compared with the control （260.57 mg/kg）.

Antrodia camphorate； solid-state fermentation； antroquinonol； response surface methodology

Q815

A

1002-6630（2015）23-0150-05

10.7506/spkx1002-6630-201523028

2014-12-23

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21306065）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20130134）

路瑞秋（1989—），女，碩士研究生，主要從事樟芝固態(tài)發(fā)酵研究。E-mail：luruiqiu2011@163.com

許贛榮（1954—），男，教授，博士，主要從事藥用真菌培養(yǎng)研究。E-mail：grxu123@126.com