不同來源北冬蟲夏草活性成分差異及其對小鼠免疫功能的影響

金莉莉，馬　俊，李　婷，婁　虹，張海波，王秋雨*

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036）

不同來源北冬蟲夏草活性成分差異及其對小鼠免疫功能的影響

金莉莉，馬俊，李婷，婁虹，張海波，王秋雨*

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036）

目的：探討不同來源北冬蟲夏草主要活性成分的差異，并評價其調(diào)節(jié)小鼠免疫功能的能力。方法：使用高效液相色譜法測定不同來源北冬蟲夏草蟲草素和腺苷的含量；通過測定小鼠免疫器官指數(shù)以及碳廓清實驗和脾淋巴細胞增殖實驗研究其對小鼠免疫功能的影響。結(jié)果：蟲草素含量由高到低依次為蠶蛹蟲草3.68 mg/g、小麥蟲草2.86 mg/g、大米蟲草2.63 mg/g、頭狀蟲草0.95 mg/g；腺苷含量由高到低依次為蠶蛹蟲草1.11 mg/g、小麥蟲草0.79 mg/g 、頭狀蟲草0.64 mg/g、大米蟲草0.094 mg/g。碳廓清指數(shù)和脾淋巴細胞增殖能力研究結(jié)果表明4 種蟲草均有提高小鼠免疫活性的功效，與空白組相比差異極顯著，蠶蛹蟲草和小麥蟲草功效最佳；飼喂4 種蟲草的小鼠免疫器官指數(shù)與空白組相比差異顯著。結(jié)論：不同來源北冬蟲夏草的蟲草素和腺苷含量有所差異，蠶蛹蟲草和小麥蟲含量最高，其提高小鼠免疫功能的能力也最強。

北冬蟲夏草；不同來源；蟲草素；腺苷；免疫功能

北冬蟲夏草（Cordyceps militaris）簡稱北蟲草，又名蛹蟲草，是我國珍貴的食藥真菌資源，與冬蟲夏草同屬，含有多種有效成分，目前公認的主要活性成分為蟲草素和腺苷［1］。蛹蟲草具有極高的藥用價值，具有抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌和增強免疫力等多種功效［1］。由于野生的天然冬蟲夏草生長條件苛刻，其產(chǎn)量受到了生長環(huán)境的限制，并且近年來被過度開采，導(dǎo)致其產(chǎn)量遠遠不能滿足人們的需求，因此人工培育的冬蟲夏草逐漸得到了廣大消費者的青睞［2］。蟲草素和腺苷是北蟲草中的主要活性成分，對其質(zhì)量控制具有重要的意義［3］。蠶蛹蟲草為以柞蠶蛹為培養(yǎng)基培育得到的北蟲草，即生長在柞蠶蛹上的北蟲草，大米蟲草和小麥蟲草分別為以大米和小麥為培養(yǎng)基培育得到的北蟲草，頭狀蟲草也是以小麥為培養(yǎng)基培育得到的北蟲草，但其子實體頭部近球形，故取名為頭狀蟲草。不同來源的北蟲草其培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)成本差異顯著，有關(guān)其活性成分含量的差異及藥物功效尚無研究報道。本研究采用高效液相色譜法測定這4 種不同來源北蟲草的主要活性成分，并研究它們對小鼠免疫功能的影響，以期為選擇優(yōu)質(zhì)北蟲草培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)品系提供理論參考。

1　材料與方法

1.1動物與材料

健康清潔級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量約30 g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

蠶蛹蟲草 遼寧鳳城蠶業(yè)研究所；小麥蟲草、大米蟲草 沈陽瑞欣養(yǎng)殖公司；頭狀蟲草 沈陽市于洪區(qū)栽培戶。

1.2試劑與儀器

蟲草素、腺苷標準品 中國藥品生物制品檢定所；印度墨水 北京市西中化工廠；乙腈（色譜純）北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；其他試劑均為分析純。

Waters e2695高效液相色譜儀（檢測器為Waters 2489，工作站為Empower） 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1蟲草素及腺苷含量測定

1.3.1.1標準品溶液的制備

分別精確稱取蟲草素和腺苷各10 mg于100 mL容量瓶中，加入甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，配制成100 μg/mL的溶液。

1.3.1.2色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），蟲草素的檢測條件參照石俊英［3］和李娟［4］等的方法；腺苷的檢測條件參照吳燕等［5］的方法。

1.3.1.3標準曲線繪制

將蟲草素和腺苷標準品均分別稀釋為1、5、10、50 μg/mL，按照1.3.1.2節(jié)色譜條件進行測定，進樣量10 μL，以蟲草素和腺苷質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程及決定系數(shù)。

1.3.1.4測試樣品溶液的制備

將4 種不同來源的蟲草烘干至恒質(zhì)量，精密稱取0.5 g經(jīng)烘干研磨的粉末溶于雙蒸水中，超聲波輔助提取2 h后，離心棄去上清液，用雙蒸水定容至50 mL，得到蟲草素測試樣品［6］；取上述經(jīng)烘干研磨的樣品0.5 g置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇10 mL，搖勻，加熱回流30 min，冷卻后稱質(zhì)量，用90%甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾得到腺苷測試樣品［7］。

1.3.1.54 種樣品蟲草素和腺苷含量的測定

分別取蟲草素和腺苷測試樣品溶液10 μL，按照

1.3.1.2節(jié)色譜條件進行測定，根據(jù)同一保留時間下的出峰面積，外標法計算4 種樣品中蟲草素和腺苷的含量。

1.3.2小鼠免疫功能測定

雄性昆明小鼠100 只隨機均分為碳廓清實驗組和脾淋巴細胞增殖實驗組，每組再分為空白組、蠶蛹蟲草組、大米蟲草組、頭狀蟲草組和小麥蟲草組（每組10 只）。實驗組小鼠按10 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計，下同）的劑量灌胃0.2 mL蟲草測試樣品（1.3.1.4節(jié)蟲草素測試樣品和腺苷測試樣品的混合物），共計28 d；空白組小鼠灌胃同體積的生理鹽水［8］。

1.3.2.1碳廓清實驗及免疫器官指數(shù)測定

末次灌胃30 min 后，于小鼠尾靜脈注射印度墨汁0.1 mL/10 g，分別于注射后2 min（t1）和10 min（t2）從眼眶靜脈叢取血20 μL，立即置于含有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的試管中，在600 nm波長處測定二者的光密度（OD）值得到OD1和OD2，按照公式（1）、（2）計算碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)a［9］。

分別處死并解剖各組小鼠，取其胸腺及脾臟，稱質(zhì)量并分別計算其與體質(zhì)量的比值，得到相應(yīng)的免疫器官指數(shù)。

1.3.2.2脾淋巴細胞增殖實驗

利用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測4 種蟲草對小鼠淋巴細胞增殖的影響，參照梁堅等［10］的方法進行。

2　結(jié)果與分析

2.14 種蟲草的蟲草素和腺苷含量

按照相應(yīng)的高效液相色譜測定條件，蟲草素和腺苷標準品溶液在1～100 μg/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為y=336 940x+37 096（ R2= 0.999 5）和y=31 647x-18 575（R2=0.999 5）。蟲草素和腺苷的出峰時間分別為4.1 min和7.4 min（圖1）。

圖1　蟲草素（A）和腺苷（B）對照品的高效液相色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of standard samples of cordycepin （A）and adenosine （B）

按照上述蟲草素測定色譜條件進樣，測定蠶蛹蟲草、大米蟲草、頭狀蟲草和小麥蟲草供試樣品溶液中蟲草素含量分別為3.68、2.63、0.95、2.86 mg/g，測定結(jié)果顯示不同來源蟲草的蟲草素含量差異較大，蠶蛹蟲草的蟲草素含量最高。

按照上述蟲草素測定色譜條件進樣，蠶蛹蟲草、大米蟲草、頭狀蟲草、小麥蟲草供試樣品溶液中腺苷含量分別為1.11、0.094、0.64、0.79 mg/g。測定結(jié)果表明不同來源蟲草的腺苷含量差異也較大，蠶蛹蟲草的蟲草素含量最高。

2.24 種蟲草對小鼠免疫功能的影響

表1　小鼠的碳廓清指數(shù)和免疫器官指數(shù)Table1　Carbon clearance index and immune organ indexes of mice

表1　小鼠的碳廓清指數(shù)和免疫器官指數(shù)Table1　Carbon clearance index and immune organ indexes of mice

注：*. 與空白組相比，差異顯著（P＜0.05）；**. 與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）；下同。同列大寫字母不同表示不同蟲草處理組之間差異顯著（P＜0.05）。

組別碳廓清指數(shù)K吞噬指數(shù)a脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)空白組0.038 6±0.004 75.907 1±0.785 50.036 4±0.011 20.001 9±0.001 0蠶蛹蟲草組0.073 1±0.015 4B**7.428 5±0.614 5A**0.054 3±0.017 3*0.002 1±0.001 0*大米蟲草組0.050 7±0.018 9A**6.540 3±0.307 3A**0.052 6±0.009 6*0.002 0±0.000 9*頭狀蟲草組0.051 8±0.012 9A**6.764 1±0.674 1A**0.044 7±0.004 3*0.002 2±0.000 8*小麥蟲草組0.062 0±0.029 8C**7.189 0±0.591 6A**0.043 2±0.019 7*0.002 1±0.001 0*

如表1所示，飼喂4 種蟲草實驗組的小鼠與空白組的小鼠相比，碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)a差異極顯著（P＜0.01）。4 種蟲草實驗組間相比，小鼠碳廓清指數(shù)K為蠶蛹蟲草＞小麥蟲草＞頭狀蟲草和大米蟲草，具有顯著差異（P＜0.05），頭狀蟲草組和大米蟲草組相比，碳廓清指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。4 個蟲草實驗組小鼠免疫器官指數(shù)與空白組相比差異顯著（P＜0.05），各蟲草實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2　小鼠的脾淋巴細胞增殖能力（xTable2　The proliferation capacity of spleen lymphocytes in mice

表2　小鼠的脾淋巴細胞增殖能力（xTable2　The proliferation capacity of spleen lymphocytes in mice

組別空白組蠶蛹蟲草組大米蟲草組頭狀蟲草組小麥蟲草組OD570nm0.142 8±0.014 10.235 6±0.018 0B**0.200 8±0.014 2A**0.201 9±0.012 9A**0.229 8±0.019 0C**

如表2所示，各蟲草實驗組與空白組相比，可明顯增強小鼠淋巴細胞的增殖率，差異極顯著（P＜0.01）。各蟲草實驗組間相比，小鼠脾淋巴細胞增殖能力為蠶蛹蟲草＞小麥蟲草＞頭狀蟲草和大米蟲草，具有顯著差異（P＜0.05），大米蟲草組和頭狀蟲草組間相比差異不顯著（P＞0.05）。

3　結(jié)論與討論

在文獻報道的基礎(chǔ)上［11-14］，本實驗分別選擇水和甲醇作為溶劑，提取樣品中的蟲草素和腺苷，經(jīng)過分析比較，發(fā)現(xiàn)測定蟲草素含量用水作為溶劑提取效果最好，而測定腺苷含量則選擇《中華人民共和國藥典》（2010年版）［7］中的方法進行提取，雖然提取過程較為復(fù)雜，但是更能精確地測定蟲草中腺苷的含量，峰型和分離效果良好。4 種蟲草中的蟲草素和腺苷含量差異顯著，蟲草素含量比較結(jié)果為：蠶蛹蟲草3.68 mg/g＞小麥蟲草2.86 mg/g＞大米蟲草2.63 mg/g＞頭狀蟲草0.95 mg/g；腺苷含量比較結(jié)果為：蠶蛹蟲草1.11 mg/g＞小麥蟲草0.79 mg/g＞頭狀蟲草0.64 mg/g＞大米蟲草0.094 mg/g。

胸腺和脾臟是哺乳動物最重要的中樞和外周免疫器官之一，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)能間接反映機體的免疫水平［15］。巨噬細胞具有吞噬、殺傷及消化病原體的功能，并在特異性免疫應(yīng)答中參與抗原提呈及免疫調(diào)節(jié)作用［16］，巨噬細胞的激活可使機體抗感染能力提高，從而增強機體的非特異性免疫功能［17］。淋巴細胞是體內(nèi)免疫活性細胞，淋巴細胞增殖能力的強弱在某種程度上代表了免疫功能的高低［18］。本研究通過對小鼠灌胃不同來源蟲草，4 個蟲草實驗組的小鼠免疫器官指數(shù)與空白組相比均有顯著差異（P＜0.05），對小鼠碳廓清指數(shù)和脾淋巴細胞增殖能力均有提高作用，3 種指標的比較結(jié)果均為蠶蛹蟲草＞小麥蟲草＞大米蟲草和頭狀蟲草。結(jié)果說明攝入一定量的蟲草可增強小鼠機體吞噬細胞的吞噬功能以及脾淋巴細胞的增殖能力，從而增強其免疫功能，其中蠶蛹蟲草提高小鼠免疫功能的效果最佳。

本研究結(jié)果表明，雖然4 種不同來源蟲草均可以提高小鼠的免疫功能，但活性成分含量較高的蠶蛹蟲草和小麥蟲草對小鼠免疫功能的影響最強，即蟲草中活性成分含量的多少與其增強小鼠免疫功能的能力成正相關(guān)。蠶蛹和小麥中的蛋白質(zhì)含量較高，充足的氮源可能對提高北蟲草中的活性成分含量具有一定的作用。本研究的結(jié)果為培養(yǎng)高質(zhì)量北蟲草提供了一定理論參考依據(jù)。

［1］ 宋江峰， 劉春泉， 李大婧， 等. HPLC-DAD測定人工北冬蟲夏草中蟲草素含量［J］. 食品科學(xué)， 2008， 29（4）： 352-354.

［2］ 張緒璋. 北冬蟲夏草的人工培植及其營養(yǎng)成分分析［J］. 中國食用菌，2003， 22（2）： 19-21.

［3］ 石俊英， 徐君， 劉獻宏， 等. RP-HPLC法測定北蟲草中腺苷、蟲草素含量［J］. 山東中醫(yī)雜志， 2008， 27（10）： 706-708.

［4］ 李娟， 王顏紅， 王世成， 等. HPLC測定人工蛹蟲草培養(yǎng)基中的蟲草素［J］. 光譜實驗， 2012， 29（6）： 3300-3303.

［5］ 吳燕， 楊濱. HPLC法同時測定保健品中腺苷和蟲草素含量的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2007， 17（6）： 983-985.

［6］ 鐘欣， 招淑艷， 劉昕. 冬蟲夏草與香棒蟲草的分子及化學(xué)指紋圖譜鑒別［J］. 中國食品學(xué)報， 2009， 9（1）： 175-182.

［7］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）［M］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 121-165.

［8］ 吳艷明， 黃文芳， 林湘. 蛹蟲草菌絲對高血脂調(diào)節(jié)作用的研究［J］. 華南師范大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版， 2008， 5（2）： 111-117.

［9］ 趙林伊， 王寶貴， 張桂英. 柞蠶蛹蟲草對小鼠免疫功能的影響［J］. 中國公共衛(wèi)生， 2004， 20（2）： 230.

［10］ 梁堅， 何勵， 傅偉忠， 等. 蟲草多肽對小鼠免疫功能的影響［J］. 中國熱帶醫(yī)學(xué)， 2007， 7（7）： 1104-1106.

［11］ 孫軍德， 白立紅， 房琳琳， 等. 蛹蟲草中蟲草素測定方法的比較［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 42（2）： 212-215.

［12］ 顏玉文， 許登泉， 趙宇蕾， 等. 腺苷和蟲草素在北蟲草子實體各部位中的分布及含量［J］. 實驗研究， 2014， 12（2）： 42-44.

［13］ 賀軍芳， 劉曉蘭， 鄭喜群， 等. HPLC測定不同產(chǎn)地蛹蟲草液體深層培養(yǎng)液中蟲草素含量［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工： 學(xué)刊， 2013（5）： 12-14.

［14］ HUANG Lei， LI Qizhang， CHEN Yiyuna， et al. Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp.［J］. African Journal Microbiology Research， 2009， 3（12）： 957-961.

［15］ 吳新正， 何迎春， 劉紅萍， 等. 紅景天復(fù)方對小鼠免疫、耐缺氧和抗疲勞能力的影響［J］. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2008， 28（1）： 29-31.

［16］ 龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］. 2版. 北京： 科學(xué)出版社， 2004： 75-93.

［17］ 黃凱， 楊新波， 黃正明， 等. 金絲桃苷對正常小鼠免疫功能的影響［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報， 2009， 25（2）： 133-135.

［18］ 帥學(xué)宏， 胡庭俊， 陳炅然， 等. 鬼臼多糖對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2008， 38（7）： 1000-1004.

Determination of Active Components in Cordyceps militaris from Different Sources and Their Impacts on Immune Function of Mice

JIN Lili， MA Jun， LI Ting， LOU Hong， ZHANG Haibo， WANG Qiuyu*
（School of Life Science， Liaoning University， Shenyang 110036， China）

Purpose： To comparatively analyze active components in Cordyceps militaris from different sources and investigate the effects of Cordyceps militaris from different sources on the immune function of mice. Methods： High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the contents of cordycepin and adenosine in four kinds of Cordyceps militaris， and their immune-regulatory effects on mice were evaluated by carbon clearance rate， immune organ indexes and proliferation capacity of spleen lymphocytes. Results： Silkworm chrysalis Cordyceps militaris， wheat Cordyceps militaris， rice Cordyceps militaris and Cordyceps capitata contained 3.68， 2.86， 2.63 and 0.95 mg/g cordycepin， and 1.11，0.79， 0.64 and 0.094 mg/g adenosine， respectively. Based on the results of carbon clearance rate， proliferation capacity of spleen lymphocytes and immune organ indexes， all the four kinds of Cordyceps militaris could increase the immune function of mice when c ompared with the control group. Meanwhile， silkworm chrysalis Cordyceps militaris and wheat Cordyceps militaris were much better in improving the immune function than those from two other sources. Conclusions： The contents of cordycepin and adenosine were significantly different among Cordyceps militaris from different sources， and Cordyceps militaris from silkworm chrysalis and wheat had higher contents of cordycepin and adenosine， and exerted more potent immune-regulatory effects on mice.

Cordyceps militaris； different sources； cordycepin； adenosine； immune function

R915

A

1002-6630（2015）13-0243-04

10.7506/spkx1002-6630-201513045

2014-07-07

沈陽市科技計劃項目（F12-277-1-40）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（L2013007）

金莉莉（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)和安全。E-mail：lilijin@lnu.edu.cn

王秋雨（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)和安全。E-mail：qiuyuwang@lnu.edu.cn