植物細(xì)胞核雄性不育相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展

劉永明，張玲，周建瑜，曹墨菊

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植物細(xì)胞核雄性不育相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展

劉永明1，張玲1，周建瑜2，曹墨菊1

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，教育部作物基因資源與遺傳改良重點(diǎn)實驗室，農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)及遺傳育種重點(diǎn)實驗室，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014

雄性不育廣泛存在于種子植物中。植物雄性不育不僅是植物生殖發(fā)育研究的重要內(nèi)容，同時也可作為雜種優(yōu)勢利用的有效工具，因而具有重要的理論和應(yīng)用價值。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中成員最多的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植株的整個生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。本文介紹了擬南芥、水稻、玉米等幾種重要模式植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控雄蕊發(fā)育的作用機(jī)制，并重點(diǎn)闡述其功能異常引起細(xì)胞核雄性不育的分子機(jī)制，以期為作物育種與理論研究提供參考。

雄性不育；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；細(xì)胞程序性死亡；轉(zhuǎn)錄組測序

植物雄性不育是指在有性生殖過程中雄蕊發(fā)育異常，不能正常產(chǎn)生有功能花粉的現(xiàn)象，包括由線粒體基因與核基因互作不協(xié)調(diào)引起的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)及由核基因單獨(dú)控制的細(xì)胞核不育(Genic male sterility, GMS)。植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育應(yīng)用于種子生產(chǎn)，必須實現(xiàn)三系配套，且大面積推廣單一不育胞質(zhì)配制的雜交種可能導(dǎo)致優(yōu)勢生理小種的出現(xiàn)。細(xì)胞核雄性不育具有敗育徹底、恢復(fù)源廣的優(yōu)勢，且不存在不育胞質(zhì)單一化使用的遺傳脆弱性。SPT(Seed production technology)技術(shù)的出現(xiàn)有效地解決了隱性核雄性不育系的保持和繁殖的問題，因此細(xì)胞核雄性不育在未來不育化制種中將發(fā)揮重要作用[1]。植物bHLHs (Basic helix-loop-helix proteins)轉(zhuǎn)錄因子家族的部分成員可通過激活或抑制一系列花發(fā)育相關(guān)基因的時空特異性表達(dá)調(diào)控植物的雄花發(fā)育。目前在擬南芥()、水稻()、玉米()等植物中發(fā)現(xiàn)某些雄性不育的發(fā)生與特異bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能異常有關(guān)。因此，了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物花粉形成過程的作用機(jī)制對探討植物雄性不育的發(fā)生機(jī)理以及促進(jìn)作物不育化制種的進(jìn)程具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 植物細(xì)胞核雄性不育

植物雄性不育在雜種優(yōu)勢利用上具有重要應(yīng)用價值，因此關(guān)于雄性不育的發(fā)生機(jī)理長期以來一直是人們研究的熱點(diǎn)。目前在玉米、水稻、番茄()和大麥()中已分別發(fā)現(xiàn)了60、63、55和50個核不育基因[2]，這些基因參與植物花粉發(fā)育的各個環(huán)節(jié)，包括減數(shù)分裂、胼胝質(zhì)代謝、絨氈層發(fā)育、花粉壁發(fā)育及花藥開裂等[3]，表明在雄蕊發(fā)育中任何一個環(huán)節(jié)的異?？赡芏紩?dǎo)致雄性不育，因而細(xì)胞核雄性不育的發(fā)生與小孢子發(fā)育相關(guān)基因的功能異常緊密相關(guān)。此外，最新研究表明植物細(xì)胞核雄性不育的發(fā)生也可能與非編碼RNA的作用有關(guān)。Ding等[4]對水稻光敏不育材料農(nóng)墾58S研究發(fā)現(xiàn)，光敏突變體中不育基因發(fā)生了G到C的單堿基突變，致使其轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA啟動子出現(xiàn)甲基化并導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄減少，而足夠劑量的RNA轉(zhuǎn)錄物對長日照條件下植株花粉產(chǎn)生是必須的，RNA轉(zhuǎn)錄量的降低最終導(dǎo)致花藥過早地程序化死亡，產(chǎn)生光敏型雄性不育植株。Zhou等[5]對水稻溫敏不育體安農(nóng)S-1的研究表明，高溫可破壞水稻花粉母細(xì)胞泛素的動態(tài)平衡，而非編碼RNA可維持細(xì)胞內(nèi)的泛素平衡，其溫敏突變體由于小RNA功能喪失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素平衡被破壞，不可溶的泛素化蛋白增加，誘發(fā)花粉母細(xì)胞液泡化，最終導(dǎo)致植株敗育。

2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子是一類能與真核基因5′端上游特定序列進(jìn)行專一性結(jié)合從而保證目的基因時空特異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。植物中轉(zhuǎn)錄因子主要包括bHLH、MYB、WRKY等家族，Jin等[6]利用軟件對植物中83個物種的轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行預(yù)測，共得到 11 428個bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，同時bHLH家族是所有轉(zhuǎn)錄因子家族中數(shù)量最多的一類，這暗示了其對于植物生長發(fā)育具有重要意義。目前對植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究主要包括兩個方面：一是利用高通量測序數(shù)據(jù)對bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定，越來越多物種的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在全基因組范圍內(nèi)得到鑒定(部分植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量見表1)；二是利用各類突變體對bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育中的功能進(jìn)行解析，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要參與種子萌發(fā)[7,8]、分枝發(fā)育[9]、花器官形成和果實發(fā)育[10,11]、激素應(yīng)答[12,13]和逆境脅迫響應(yīng)[14,15]等過程。

表1 植物中已鑒定的bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量

bHLH 基序包含約60個氨基酸，由N端富含堿性氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)和C端的螺旋-環(huán)-螺旋組成，其中N端的堿性區(qū)域可與下游基因啟動子區(qū)的E-box(5′-CANNTG-3′)元件結(jié)合，并對目的基因的表達(dá)進(jìn)行特異調(diào)控，而C端的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域負(fù)責(zé)與其他bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成同源或者異源二聚體行使功能[31]。bHLH蛋白在生物體內(nèi)的功能與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。Ko等[32]對水稻細(xì)胞核雄性不育的兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子bHLH142、TDR1研究發(fā)現(xiàn)，這兩個bHLH蛋白單獨(dú)作用時不能調(diào)控下游基因的表達(dá)，而只有當(dāng)編碼蛋白與TDR1蛋白發(fā)生互作形成二聚體之后才能促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)。動物中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，Chang等[33]對人類和果蠅的促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(Epithelial-mesenchy-mal transition, EMT)的bHLH蛋白TWIST研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)TWIST1與TWIST47形成特異的二聚體結(jié)構(gòu)才能與下游基因的E-box結(jié)合進(jìn)而執(zhí)行其功能。由此可見，在探究某一bHLH蛋白與其下游靶基因是否具有直接互作時，需要考慮bHLH蛋白須以二聚體行使功能這一特性。同時，bHLH蛋白對下游靶基因的識別也可能受到其他因子的調(diào)控，如對bHLH轉(zhuǎn)錄因子活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用的DNA結(jié)合抑制因子(Inhibitor of DNA binding, ID)。ID可與bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異二聚體，但因其本身不包含與DNA 結(jié)合必需的堿性氨基酸序列，致使異二聚體無法與靶基因啟動子區(qū)域的E-box結(jié)合，從而阻止bHLH轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[34,35](圖1)。同時，ID蛋白的相互作用對bHLH轉(zhuǎn)錄因子的活性起到重要的調(diào)控作用，Sharma等[36]發(fā)現(xiàn)ID4可與bHLH轉(zhuǎn)錄抑制因子ID1、ID2、ID3形成異二聚體來阻止轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能，并促進(jìn)bHLH因子的轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖1 ID2對bHLH轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性抑制作用(引自文獻(xiàn)[35])

A：兩個bHLH蛋白形成二聚體，并與基因啟動子結(jié)合從而促進(jìn)的表達(dá)；B：ID2蛋白與bHLH蛋白形成異二聚體，由于ID2不含有與DNA結(jié)合的堿性氨基酸序列，形成的異二聚體不能與下游啟動子序列結(jié)合，無法促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。

3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與植物雄性不育

目前已報道的與花粉形成相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子大部分參與花藥絨氈層的發(fā)育或小孢子發(fā)育。花藥絨氈層對花粉的生長發(fā)育至關(guān)重要，除了為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)，絨氈層分泌的胼胝質(zhì)酶能夠適時地分解花粉母細(xì)胞和四分體的胼胝質(zhì)壁，以保證小孢子彼此分離；同時絨氈層還能分泌一些物質(zhì)參與授粉過程中花粉與柱頭細(xì)胞的識別[37]。已有研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能異常引起的不育植株在敗育特征上具有一定的相似性，即雄性不育突變體往往表現(xiàn)出絨氈層細(xì)胞提前或延遲降解，致使花粉形成受阻表現(xiàn)敗育(表2)。目前已被鑒定出的參與小孢子發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要集中在擬南芥、水稻、玉米等模式植物中，在其他植物中參與植物小孢子發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的報道較少。對花粉發(fā)育相關(guān)bHLH蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)不同物種間參與小孢子發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有高度的同源性(圖2)。由此可見，分析比較這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能特征，對于挖掘其他植物中參與花粉形成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能具有重要意義。

表2 植物細(xì)胞核雄性不育相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子

注：bHLH轉(zhuǎn)錄因子序號參考文獻(xiàn)[18]。

圖2 已鑒定的小孢子發(fā)育相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系

用NJ法、MEGA5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap為1000次重復(fù)。

3.1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥雄性不育

目前在擬南芥全基因組內(nèi)已經(jīng)鑒定出167個bHLH轉(zhuǎn)錄因子[16]。Dukowic等[38]對擬南芥和玉米的花粉母細(xì)胞、成熟花藥及種子的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)14個擬南芥bHLH基因和3個玉米bHLH基因在減數(shù)分裂時期表達(dá)上調(diào)，并且玉米中3個上調(diào)表達(dá)的bHLH基因在擬南芥中的14個上調(diào)表達(dá)的bHLH基因中都有對應(yīng)的同源基因。Yang等[39]利用單細(xì)胞測序技術(shù)對擬南芥花粉母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定了在花粉母細(xì)胞時期特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中bHLH家族成員占有較大比例。Zhang等[40]對擬南芥花發(fā)育早、中、晚3個時期轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析比較，也發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在所有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中占有較大比重，同時這些差異表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要集中在雄蕊發(fā)育的花序分生組織(Inflorescent meristem, IM)，說明bHLH轉(zhuǎn)錄因子對雄蕊早期發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。

Sorensen等[41]首先在由T-DNA插入構(gòu)建的擬南芥突變體庫中鑒定出一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能異常引起的雄性不育突變體，該雄性不育突變體表現(xiàn)出絨氈層發(fā)育不正常、小孢子提前降解等特征，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)()編碼蛋白在花藥絨氈層的發(fā)育和小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中起重要調(diào)控作用。Thorstensen等[42]通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)AMS與擬南芥花藥發(fā)育有關(guān)的蛋白ASHR3存在互作，并推測它們之間的互作對雄蕊發(fā)育具有重要意義。Xu等[43]通過基因表達(dá)譜分析并結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)等手段鑒定了花粉形成過程中受AMS蛋白調(diào)控的23個基因，這些基因分別參與花粉壁形成中的胼胝質(zhì)及初生外壁的合成和孢粉素合成、運(yùn)輸、沉積等一系列代謝過程，表明在花粉壁發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ma等[44]對野生型和不育突變體的未成熟花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選到參與代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、泛素化及抗逆等途徑的1368個差異表達(dá)基因，表明基因還可能在植物發(fā)育的其他生理和代謝過程中發(fā)揮作用。Zhang等[45]在擬南芥Ds轉(zhuǎn)座子插入突變體庫中鑒定得到一個雄性不育突變體，該突變體絨氈層細(xì)胞高度液泡化并缺少正常細(xì)胞質(zhì)，雖然其性母細(xì)胞能正常進(jìn)行減數(shù)分裂I，但由于沒有胼胝質(zhì)，不能完成減數(shù)分裂就解體，最終不能形成花粉而導(dǎo)致不育。DYT1是一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控參與花藥絨氈層的分化和發(fā)育過程中的基因表達(dá)。例如，在突變體中很多絨氈層特異表達(dá)的基因表達(dá)量相對于野生型顯著降低[45]，而Feng等[46]利用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)如、、等很多花藥發(fā)育基因都受到DYT1的調(diào)控。此外，DYT1還可與R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子TDF1互作共同參與擬南芥絨氈層發(fā)育及花粉壁的形成[47]。Zhu等[48]鑒定了3個與DYT1存在互作的bHLH轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH10、AtbHLH89和AtbHLH91，并發(fā)現(xiàn)這3個bHLH轉(zhuǎn)錄因子對雄花花藥的發(fā)育存在功能互補(bǔ)現(xiàn)象，單突變株與野生型一致，但雙突變及三突變體會表現(xiàn)出雄性不育現(xiàn)象。

bHLH基因編碼蛋白還可以通過調(diào)節(jié)植物信號物質(zhì)的合成與應(yīng)答來參與雄蕊發(fā)育。茉莉酸(Jasmonic acid, JA)可誘導(dǎo)和協(xié)調(diào)花藥開裂和釋放花粉等過程，JA合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的植株大多也會出現(xiàn)雄性不育或育性降低。Nakata等[13,49]在擬南芥中鑒定出參與茉莉酸信號傳導(dǎo)的3個bHLH轉(zhuǎn)錄因子JAM1JAM2和JAM3，并分別將3個轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出雄蕊育性降低，暗示這3個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥雄蕊發(fā)育中起負(fù)調(diào)控作用。Figueroa等[50]發(fā)現(xiàn)MYC5(AtbHLH28)能參與雄蕊發(fā)育中茉莉酸應(yīng)答途徑，同時為避免轉(zhuǎn)錄因子同源家族基因功能的補(bǔ)償，利用嵌合阻遏基因沉默技術(shù)(The chimeric repressor silencing technology, CRES-T)抑制下游靶基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株雄蕊表現(xiàn)出花絲不伸長、花藥不開裂以及花粉無活力等敗育特征。Xing等[51]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)1個參與油菜素內(nèi)酯信號傳遞的bHLH轉(zhuǎn)錄因子BIM1，雖然其突變體與野生型在雄蕊育性表現(xiàn)上基本一致，但與花發(fā)育相關(guān)基因形成的雙突變體相對于半不育的單突變體，表現(xiàn)出花藥明顯異常、自交結(jié)實率明顯降低，說明BIM1可與SPL8發(fā)生協(xié)同作用進(jìn)而調(diào)控擬南芥雄蕊的發(fā)育。

3.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與水稻雄性不育

基于水稻全基因測序數(shù)據(jù)并通過軟件預(yù)測，目前在水稻全基因組中共鑒定出178個bHLH轉(zhuǎn)錄因子[16]，其中已報道參與小孢子發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子包括UDT1(OsbHLH164)TDR1(OsbHLH5)EAT1/DTD(OsbHLH141)和bHLH142/TIP2(OsbHLH142)等，它們大部分在絨氈層細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)和花粉形成過程中起關(guān)鍵作用，其功能異常往往會引起雄性不育。同時，研究表明這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子的相互作用在水稻花粉形成過程中具有重要作用(圖3)，他們的功能異常所引起的細(xì)胞核雄性不育在細(xì)胞學(xué)水平上也具有一定的相似性(表2)。

圖3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子在水稻花粉形成過程中調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(參考文獻(xiàn)[56]修改繪制)

Jung等[52]在水稻中鑒定了1個bHLH轉(zhuǎn)錄因子UDT1，其T-DNA插入形成的不育突變體主要表現(xiàn)出：植株雄蕊中周緣細(xì)胞異常分化，絨氈層液泡化，中層不能降解，小孢子發(fā)育受阻，花粉囊內(nèi)無法形成花粉粒，最終引起植株不育。水稻中bHLH蛋白TDR1對絨氈層細(xì)胞降解和花藥發(fā)育是必需的，其在花藥發(fā)育早期的絨氈層細(xì)胞中特異積累[53]，并可對絨氈層降解過程中的半胱氨酸蛋白酶基因和蛋白酶抑制基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。突變體絨氈層細(xì)胞不能及時降解，小孢子由于能量供應(yīng)不足從四分體釋放后即解體，從而表現(xiàn)植株敗育[54]。水稻EAT1蛋白可與編碼產(chǎn)物形成蛋白復(fù)合物，并調(diào)控下游誘導(dǎo)絨氈層細(xì)胞程序性死亡的和等基因的表達(dá)。水稻突變體敗育特征與類似，雖然可通過減數(shù)分裂形成小孢子，但由于絨氈層細(xì)胞PCD延遲，使小孢子能量供應(yīng)不足，從四分體釋放后即被降解，最終無法形成有功能的花粉粒[55,56]。Fu等[57]通過60Co-γ射線進(jìn)行輻射誘變獲得一個水稻雄性不育突變體，Ko等[32]利用T-DNA插入突變技術(shù)獲得水稻雄性不育突變體，研究發(fā)現(xiàn)這兩個雄性不育突變體都是由于轉(zhuǎn)錄因子bHLH142功能異常引起。突變體花藥壁包含未分化的表皮、纖維層、中層，并且絨氈層不能正常解體，最終由于沒有正常的小孢子形成導(dǎo)致植株雄性不育。通過DAPI組織染色與基因表達(dá)模式分析驗證了其主要在花藥發(fā)育早期花藥壁內(nèi)3層細(xì)胞的分裂分化中起關(guān)鍵作用。Fu和Ko兩個研究組同時發(fā)現(xiàn)bHLH142可調(diào)控和兩個基因的表達(dá)，雖然bHLH142可與TDR1形成蛋白復(fù)合體促進(jìn)絨氈層的細(xì)胞分化，但bHLH142并不能直接調(diào)控，而需要先與TDR1形成蛋白復(fù)合物，進(jìn)而才能通過調(diào)控下游基因的表達(dá)以調(diào)節(jié)絨氈層的程序性死亡過程，進(jìn)而參與花粉的正常發(fā)育。

目前鑒定的參與水稻花粉形成的4個bHLH轉(zhuǎn)錄因子均與絨氈層細(xì)胞的發(fā)育以及程序性死亡有關(guān)，其中UDT1居于上游，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而bHLH142與TDR1蛋白互作形成的復(fù)合體可對下游基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，基因直接調(diào)控絨氈層PCD相關(guān)基因的表達(dá)保證小孢子正常的發(fā)育(圖3)，可見bHLH轉(zhuǎn)錄因子并不都是單獨(dú)發(fā)揮功能，部分bHLH蛋白間的相互協(xié)作在花粉形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。水稻中4個與花粉形成相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能解析均得益于相關(guān)基因突變體的發(fā)現(xiàn)，但是針對某一特定或若干未知功能的bHLH基因進(jìn)行功能解析較為困難，因此Crismani等[58]與Romero[59]等分別通過對水稻花藥轉(zhuǎn)錄組及蛋白組進(jìn)行測序鑒定出了一系列參與花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，這對進(jìn)一步解析bHLH轉(zhuǎn)錄因子與花粉形成之間的關(guān)系具有重要參考價值。

3.3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與玉米雄性不育

Jiang等[29]通過對玉米全基因組內(nèi)各個轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子是玉米中數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族(8.35%)，這暗示bHLH家族在玉米生長發(fā)育中的重要性。Zhang等[60]通過對小孢子發(fā)育過程中的5個時期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定了在各個時期特異表達(dá)的bHLH基因，發(fā)現(xiàn)隨著小孢子的發(fā)育，這些bHLH基因的表達(dá)豐度也在不斷變化。Dukowic等[61]通過對花粉母細(xì)胞前期I的花藥、成熟花藥及種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了在減數(shù)分裂中差異表達(dá)的bHLH基因，其中大部分bHLH基因相對于其他時期都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子對植物生殖發(fā)育的調(diào)控具有嚴(yán)格的時空特異性。

Moon等[62]克隆了玉米細(xì)胞核雄性不育基因，該基因編碼1個bHLH蛋白，野生型中該基因通過促進(jìn)絨氈層分化和抑制絨氈層細(xì)胞的平周分裂保證花藥的正常形成，而其突變體絨氈層分化失敗，絨氈層細(xì)胞通過多余的平周分裂產(chǎn)生了冗余的細(xì)胞層，導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻。Ren等[63]克隆了位于細(xì)胞核中的玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)主效基因，其編碼產(chǎn)物含有1個bHLH結(jié)構(gòu)域，且不具有線粒體定位序列，表明作為一個轉(zhuǎn)錄因子可能是通過影響下游基因的表達(dá)，間接作用于線粒體中的不育基因，從而使C胞質(zhì)育性恢復(fù)。

3.4 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與其他植物雄性不育

除了上述模式植物，在其他植物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子與花粉育性的關(guān)系也有報道。Liu等[64]在大白菜()中發(fā)現(xiàn)一個正向調(diào)控花粉形成的bHLH基因，其編碼產(chǎn)物同小孢子減數(shù)分裂相關(guān)的BcSKP1蛋白間的互作參與大白菜雄蕊正常發(fā)育。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)化至油菜()中并利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(Virus-induced gene silencing, VIGS)抑制基因表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株絨氈層細(xì)胞不能正常降解，小孢子發(fā)育受阻，表現(xiàn)雄性不育。Jeong等[65]從番茄中克隆一個在花粉母細(xì)胞和絨氈層中高表達(dá)bHLH基因Ms10其突變體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常不能形成四分體，絨氈層異常液泡化，最終導(dǎo)致雄性不育。通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了35可能調(diào)控的246個基因，這些基因分別參與減數(shù)分裂、絨氈層發(fā)育、花粉壁形成等過程，表明Ms10在小孢子形成的減數(shù)分裂和絨氈層細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控功能。

4 結(jié)語與展望

目前在植物中已鑒定出部分參與植物小孢子形成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控參與花藥絨氈層降解、孢粉素合成等過程相關(guān)基因的表達(dá)[43]。小孢子發(fā)育相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能異常往往導(dǎo)致植株雄性不育，這些不育突變體敗育方式多樣，敗育程度各異。例如，在擬南芥中，雄性不育突變體沒有花粉形成表現(xiàn)為完全敗育；不育突變體會出現(xiàn)少量花粉并可自交結(jié)實；而AtbHLH10、AtbHLH89和AtbHLH91等轉(zhuǎn)錄因子在雙突變或三突變時植株才表現(xiàn)敗育。這種在敗育方式及敗育程度上的的差別可能暗示著各個bHLH轉(zhuǎn)錄因子在雄蕊發(fā)育的不同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或者同一功能網(wǎng)絡(luò)的不同層次發(fā)揮作用，具體機(jī)制尚待研究。不同植物中參與小孢子發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子氨基酸殘基序列的一致性較高。例如，OsUDT1與ZmMS32、OsbHLH142與ZmRf4的氨基酸殘基序列一致性分別達(dá)到67.52%和66.85%，他們在蛋白質(zhì)序列上的相似性對于解析物種間bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有一定參考，但目前對不同物種間的同源bHLH轉(zhuǎn)錄因子在小孢子發(fā)育中的功能異同的相關(guān)報道較少。同時，水稻中bHLH轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的小孢子發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在其他植物中是否存在相似功能網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過介導(dǎo)內(nèi)源激素的合成與應(yīng)答參與小孢子發(fā)育，在其他植物中是否存在類似機(jī)制，及這種機(jī)制同參與絨氈層發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子作用網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系仍需深入研究。

目前發(fā)現(xiàn)和鑒定參與植物雄花發(fā)育的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的策略主要有兩種：一是依賴于各類突變或轉(zhuǎn)基因技術(shù)。例如，通過γ射線處理改變了、等基因堿基序列進(jìn)而獲得不育突變體和通過T-DNA插入目的基因區(qū)域獲得、兩個基因的突變體，而和等bHLH基因是通過抑制或過表達(dá)獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而解析其功能。依靠物理、化學(xué)或生物技術(shù)手段獲得目的基因的突變體對于基因功能研究具有重要意義，也是目前研究基因功能的經(jīng)典方法和主要技術(shù)基礎(chǔ)。但雄性不育突變體的數(shù)量有限，對于基因間的互作及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析具有一定局限性。二是依賴于高通量測序技術(shù)，解析基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白組等組學(xué)水平上的測序數(shù)據(jù)，不僅豐富了人們進(jìn)行基因功能研究的手段，同時也為探究基因互作與基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了便利。目前在水稻、擬南芥和玉米等植物中，利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測序技術(shù)，已經(jīng)發(fā)掘了許多雄蕊發(fā)育關(guān)鍵時期特異表達(dá)的bHLH基因，可利用TALEN、CRISPR/Cas等基因編輯技術(shù)對這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能解析，以便全面的了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物雄花發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

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Research progress of the bHLH transcription factors involved in genic male sterility in plants

Yongming Liu1, Ling Zhang1, Jianyu Zhou2, Moju Cao1

Male sterility exists widely in the spermatophytes. It contributes to the study of plant reproductive development and can be used as an effective tool for hybrid seed production in heterosis utilization. Therefore, the study on male sterility is of great value in both theory and application. As one of the largest transcription factor families in plants, basic helix-loop-helix proteins (bHLHs) play a crucial role in regulating plant growth and development. This paper introduces the mechanism of bHLH regulating stamen development in several important model plants. Furthermore, we discuss the molecular mechanisms of genic male sterility resulting from bHLH dysfunction to provide

for crop breeding and theoretical studies.

male sterility; bHLH transcription factor; programmed cell death; transcriptome sequencing

2015-05-19;

2015-07-19

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(863計劃)(編號：2011AA10A103)資助

劉永明，博士研究生，專業(yè)方向：玉米生物技術(shù)育種。E-mail: liuluckforever@163.com

曹墨菊，教授，研究方向：玉米雄性不育。E-mail: caomj@sicau.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-229

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-10-15 9:35:48

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20151015.0935.001.html

(責(zé)任編委: 張憲省)