黑曲霉菌降解黃曲霉毒素B1的影響因素的研究

陳志輝，徐馨，李仲玉，程寶晶，*

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江齊齊哈爾161000）

黑曲霉菌降解黃曲霉毒素B1的影響因素的研究

陳志輝1，徐馨2，李仲玉1，程寶晶1，*

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江齊齊哈爾161000）

谷物類原料因保管不善造成或加工過程中操作不當易產生大量黃曲霉毒素B1。目前，微生物法已成為降解黃曲霉毒素B1的研究熱點。本研究用已篩選出具有降解黃曲霉毒素B1能力的黑曲霉菌為研究對象，從發(fā)酵液不同處理方式，熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性，金屬離子穩(wěn)定性等方面，對其降解的影響因素進行了研究。通過對其發(fā)酵液不同處理途徑和不同條件對其降解黃曲霉毒素B1能力的影響的研究，初步判斷篩選菌株是通過直接代謝和分泌胞外酶兩種途徑共同降解黃曲霉毒素B1的，而分泌胞外酶又是其主要的降解黃曲霉毒素B1的手段，因此易受溫度、pH、和金屬離子的影響。

黃曲霉毒素B1；降解；黑曲霉菌；影響因素

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由寄生曲霉和黃曲霉產生的具有強烈毒性的次生代謝產物，也是目前所有發(fā)現真菌類毒素中毒性最大的［1］。AFB1毒性是氰化鉀100倍，致癌作用是已知化學致癌物中最強的，致癌性比二甲基亞硝胺強75倍［2-3］。AFB1污染范圍廣泛，可發(fā)生在糧食、油料、干果、調味品、乳制品、肉類上，尤其以谷物原料最易受到污染，如果這些受到污染嚴重食物原料進入到流通環(huán)節(jié)將嚴重威脅到消費者的健康［4］。目前，微生物法以其節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點，已成為去除或降低谷物原料中AFB1毒性的研究熱點［5］，但其降解的影響因素還不甚明了。本研究用本實驗室已篩選出的具有降解AFB1能力的黑曲霉菌為研究對象，從發(fā)酵液不同處理方式，熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性，金屬離子穩(wěn)定性等方面，對其降解的影響因素進行了研究。通過對其發(fā)酵液不同處理方式和不同因素對其降解AFB1能力的影響的研究，以其為更好利用微生物降解谷物原料中的AFB1，減少其對人類健康的威脅，為微生物法降解AFB1能夠在工業(yè)生產中廣泛應用提供理論支持和科學參考。

1材料與方法

1.1材料

實驗菌株為本實驗室自行篩選具有較好降解AFB1能力的一株黑曲霉菌（Aspergillus niger）。篩選菌株經PDA瓊脂培養(yǎng)基活化，挑取生長較好菌落，接種于NB培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)24 h后，按3%接種于改良的馬丁氏培養(yǎng)基中，在34℃，pH 5.5，轉速160 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。

菌株發(fā)酵選用改良的馬丁氏培養(yǎng)基，配方為：淀粉40.0 g；胰蛋白胨5.0 g；酵母膏2.0 g；磷酸氫二鉀1.0 g；硫酸鎂0.5 g；去離子水1 000 mL；pH 5.5，121℃滅菌20 min。

AFB1標準品購自美國Sigma公司；AFB1采用ELISA法測定，試劑盒購自北京百林康源公司。

1.2方法

1.2.1不同處理方式發(fā)酵液降解效果的比較

實驗各分組方式見表1，空白組僅添加AFB1（使終濃度為10 μg/L，下同）；對照組既添加AFB1同時又接種篩選菌（接種量3%），其余3組處理方式如表1所示。

表1　各分組處理方式Table 1Approach of each group

將5組在32℃，200 r/min條件下搖床培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)后，對僅接種篩選菌的3組進行再處理后，分別檢測各組對AFB1的降解率。

1.2.2溫度對發(fā)酵上清液降解效果的影響

1）高溫處理對離心上清液降解AFB1的影響。取1.2.1離心上清液，分別置于50℃和60℃水浴鍋中，保存2、4h和6h，取出后迅速置于冷水冷卻，添加AFB1，32℃，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

2）不同溫度對離心上清液降解AFB1效果的影響。取1.2.1離心上清液添加AFB1，分別在20、25、30、 35、40、45℃和50℃條件下，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

1.2.3pH對發(fā)酵上清液降解效果的影響

1）不同pH處理對離心上清液降解AFB1的影響。取1.2.1離心上清液，分別調節(jié)pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，4℃下放置3 h和6 h后，添加AFB1，32℃，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

2）不同pH對離心上清液降解AFB1效果的影響。取1.2.1離心上清液添加AFB1，分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0條件下，32℃，pH 6.0，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1的降解率。

1.2.4金屬離子對發(fā)酵上清液降解效果的影響

取1.2.1中離心上清液，添加AFB1，同時添加金屬離子（Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+、Fe2+、Fe3+），使其濃度均為c=5.0 mmol/L，32℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，檢測AFB1降解率。

2結果與分析

2.1不同處理方式發(fā)酵液降解AFB1效果的比較

不同處理方式發(fā)酵液對AFB1的降解效果見表2。

表2　培養(yǎng)液不同處理方式對AFB1降解率的影響Table 2Degradation rate of AFB1by different approach of fermentation broth

發(fā)酵液加熱滅活24h內對AFB1的降解率為5.9%、發(fā)酵液離心獲得的的上清液為43.4%，離心沉淀物經超聲破碎后重新溶解液為0.8%，而空白組和對照組則分別為0.0%和58.4%，從結果可以發(fā)現，3個處理組都達不到同時間活菌對照組的對AFB1降解率。降解效果分別只達到了對照組的10.1%、74.3%、1.4%。3個處理組降解率之和也僅為活菌對照組的85.8%，但其離心上清液仍然是主要降解源。

2.2溫度對離心上清液降解AFB1效果的影響

由表3可知，離心上清液AFB1降解率隨熱處理時間延長而降低；而且60℃處理組降解率下降幅度要高于50℃處理組，說明離心上清液對AFB1降解熱穩(wěn)定性差，在溫度較高比較容易失去降解能力。

離心上清液在不同溫度條件下對AFB1的降解率見表4。

由表可知，35℃以下時降解率隨著反應溫度增大，AFB1的降解率隨之增加，而35℃后降解率則快速下降，因此，發(fā)酵上清液降解AFB1受溫度影響較大，而且35℃為離心上清液降解AFB1的最適溫度。

表3　高溫處理對離心上清液AFB1降解率的影響Table 3Effect of high temperature of the supernatant on degradation of AFB1%

表4　不同溫度處理對離心上清液降解AFB1的影響Table 4Effect of different temperatures on the supernatant degradation rate of AFB1%

2.3pH對離心上清液降解AFB1效果的影響

pH對離心上清液降解AFB1效果的影響見表5。

表5　不同pH處理對離心上清液降解AFB1的影響Table 5Effect of different pH of the supernatant on degradation rate of AFB1%

如表5所示，在pH呈弱堿性條件下（pH=7.0～9.0）時，離心上清液相對穩(wěn)定，處理3 h與處理6 h對其降解率的影響不大；pH<6.0時，離心上清液的降解效果較差，并且，其降解效果隨pH的降低和處理時間的加長而迅速下降。

由表6可知，pH<6.0時，離心上清液對AFB1的降解率迅速降低；pH>6.0時，對AFB1的降解率變化較為平緩緩慢，其中pH=6.0時，降解率最高。

2.4金屬離子對離心上清液降解AFB1效果的影響

不同金屬離子對離心上清液降解能力的影響見表7。

表6　不同pH對離心上清液降解AFB1的影響Table 6Effect of different pH of the supernatant on degradation rate of AFB1%

表7　添加金屬離子對離心上清液降解AFB1的影響Table 7Effect of different metal ion of the supernatant on degradation rate of AFB1

不同金屬離子對離心上清液的影響不盡相同，在c=5.0 mmol/L的濃度下，Li+、Na+、K+等堿金屬離子對可略微降低其降解能力；除Mn+2外，大多數二價陽離子對其降解能力均有較強的抑制作用；而Pb2+、Cu2+和Fe3+則對其表現出強烈的抑制作用。

3結論與討論

為研究篩選黑曲霉菌的降解AFB1的影響因素，本試驗對發(fā)酵液進行了5種不同的處理方式。從試驗結果看，對照組的降解率最高，離心上清組、加熱滅活組、離心沉淀組均低于對照組但也有一定的降解能力，說明黑曲霉菌對AFB1的降解是一個綜合的生物過程，而這3組降解能力之和也略低于對照組，可能是因為黑曲霉菌在生長過程中對AFB1存在一定的代謝能力。離心上清組的降解能力遠高于加熱滅活組，這可能是因為黑曲霉菌對AFB1降解主要是通過一種熱不穩(wěn)定的生物活性物質來實現的，初步猜測是一種胞外酶，而發(fā)酵上清液也是篩選菌株降解AFB1的主要場所。加熱滅活組、離心沉淀組也有一定的降解能力，說明在黑曲霉菌降解AFB1的過程中還有一部分非蛋白類物質和胞內酶的存在，這可能與黑曲霉菌代謝AFB1有關。但在本試驗中還發(fā)現，各處理組降解能力之和依然低于活菌對照組的降解能力，說明在發(fā)酵降解過程中，有一部分AFB1可能是通過被篩選菌株直接代謝降解掉的。

蛋白質功能性會受到溫度、pH和金屬離子影響。溫度過低會降低酶促反應k值，從而降低整個酶解反應；溫度過高又會造成蛋白變性，使蛋白功能缺失。pH高低又會因為蛋白等電點不同，而使蛋白空間結構發(fā)生改變，進而使其生物學活性降低［6］。金屬離子又是條件酶活性的重要物質，對酶的生物活性起到激活或抑制作用［7］。在以往研究中，經常研究活性物質是否會受到以上3個條件影響來判斷該生物活性物質是否為一種酶。因此，本試驗為進一步確定發(fā)酵上清液中的具有降解AFB1的活性物質是否為一種胞外酶，也針對這3個條件對離心上清液降解能力的影響進行了研究。

本研究結果發(fā)現，隨著反應溫度增大，離心上清液中的AFB1降解率隨之增加，35℃為其最適作用溫度。溫度在30℃以下時，低溫時降解活性受抑制，而溫度升至40℃以上，其降解能力迅速下降；隨著熱處理時間延長，AFB1的降解率隨之降低；且溫度越高，活性喪失越嚴重，降解率越低。在60℃下處理6 h，保留了未處理前7%的活力，說明其對溫度較為敏感。

離心上清液的最適反應pH為6.0～7.0，在酸性或過堿性條件下活性均較低。尤其是當pH低于5時，酶活性降到不足最高活性的50%，這可能是由于pH下降，降低到了該酶的等電點，使其發(fā)生部分變性引起的；發(fā)酵上清液在pH呈弱堿性條件下（pH 7.0～9.0）時相對穩(wěn)定，pH小于6.0時活性迅速降低，這可能是由于pH降低，引起該酶空間結構發(fā)生變化，部分變性，從而導致活性降低。

有研究表明，Ca2+、Mg2+能明顯促進黃色短桿菌去除毒素［8］。朱新貴等（2010）也得出結論添加Ca2+和Mg2+可促進枯草桿菌對AFB1的去除［9］。本試驗中，離心上清液中添加不同金屬離子對該降解酶的活力的影響有很大差異，在c=5.0 mmol/L的濃度下，一價堿金屬離子對其活性影響不顯著；除Mn2+外，大多數二價離子對酶活均有較強的抑制作用；而Pb2+、Cu2+和Fe3+則對其表現出強烈的抑制作用，這可能是由于重金屬使酶發(fā)生變性或者高價態(tài)離子使其氧化變性所致。而且與其他人所得到的結果不同［10-11］，本試驗中所有的金屬離子均對酶活有不同程度的抑制作用，說明本試驗中的降解酶受在高金屬離子濃度的條件下受到負向調控。

在本試驗中，離心上清液作為篩選菌株降解AFB1的主要場所，其降解能力較易受到溫度、pH和金屬離子的影響，而這與功能性蛋白的特性十分相近，因此判斷本試驗的篩選菌株是通過向發(fā)酵液中分泌胞外酶的途徑來降解AFB1的。

在本試驗中，活菌對照組對AFB1的降解能力高于其它各處理組之和，綜合以上研究推測，原因可能是篩選菌株將一部分降解后的AFB1產物吸收到菌體內作為其生命活動的碳來源，而降解產物的減少又催化胞外降解酶降解了更多的AFB1底物，而在單獨使用發(fā)酵上清液處理AFB1時，由于缺少了活菌對降解產物的代謝，使酶解反應更容易達到平衡，造成其降解能力低于活菌對照組。因此，在未來的試驗中，如何建設AFB1的酶解產物，進一步增加其降解率，是除了發(fā)酵降解條件優(yōu)化外，提高本試驗中篩選菌株降解AFB1的另外一個有效的研究方向。

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Study on the Effect Factors of Degradation of Aflatoxin B1by Aspergillus Niger

CHEN Zhi-hui1，XU Xin2，LI Zhong-yu1，CHENG Bao-jing1，*
（1.College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161000，Heilongjiang，China）

Aflatoxin B1（AFB1），as a kind of mycotoxin produced by Aspergillus spp.，was a highly toxic substance and widely distributed in food matrix.Microbiological was major research method of the degradation of AFB1.The study use screened Aspergillus niger which can degrade AFB1，through different treatment of fermentation broth，thermal stability，pH stability，and the stability of the metal ions of the fermentation broth，to research the effect factors of AFB1degradation.Through its fermentation broth different handling methods and different conditions of its degradation of AFB1ability of research，initially determine the screening strains by metabolism and secretion of extracellular enzymes to degrade AFB1，while the secretion of extracellular enzymes is main means of AFB1degradation.

Aflatoxin B1；degradation；Aspergillus niger；effect factors

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.028

2013-12-07

國家自然科學基金項目（No.31072046）；現代化農業(yè)體現項目（CARS-36）

陳志輝（1980—），男（漢），實驗師，碩士，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學。