連花清瘟顆粒微生物限度檢查方法的研究

北京以嶺藥業(yè)有限公司（102600）李志紅 王磊 李海南 王彥彥

1 材料與儀器

樣品為連花清瘟顆粒三批，批號分別為091201、091202、091203，由北京以嶺藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，按說明書要求配制，121℃濕熱滅菌15 min，備用。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]，大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]，乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]，黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]。

脈動真空滅菌器（XG1.G型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型，蘇州凈化設(shè)備有限公司），生化培養(yǎng)箱（LRH-250F,上海一恒科技有限公司），霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250Ⅱ型，上海一恒科技有限公司），電熱恒溫水箱（HHW21.420型，天津泰斯特儀器有限公司）。

2 預(yù)試驗(yàn)[1]

按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法中的平皿法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小于70%，其余試驗(yàn)菌株的回收率均大于70%，采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)（1∶10供試液，0.2ml/皿），金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均大于70%。

采用常規(guī)法對樣品進(jìn)行大腸埃希菌檢查，結(jié)果陽性菌生長良好，說明本品在該條件下對大腸埃希菌的抑制作用可以忽略。

據(jù)此，擬定本品的微生物限度檢查方法草案如下。

取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液；細(xì)菌數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10的供試液1ml，等量分注于5個平皿中，每皿0.2ml；霉菌及酵母菌數(shù)采用平皿法，取1∶10的供試液1ml，注入平皿中，每皿1ml；大腸埃希菌采用常規(guī)法。

3 方法學(xué)驗(yàn)證[1][4]

3.1 菌液的制備按照中國藥典2010年版一部附錄微生物限度檢查法進(jìn)行。

3.2 供試液的制備

取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。

3.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

3.3.1 試驗(yàn)組

取1∶10供試液0.2ml和枯草芽孢桿菌菌液1ml，分別注入同一平皿中，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后置30℃～35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，計(jì)數(shù)。用同樣的方法對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行試驗(yàn)。

取1∶10供試液1ml和白色念珠菌菌液1ml，分別注入同一平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，混勻，待凝固后置23℃～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。

取1∶10供試液1ml和黑曲霉孢子懸液1ml，分別注入同一平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，混勻，待凝固后置23℃～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。

結(jié)果見附表1。

3.3.2 菌液組

分別取上述菌液1ml，采用平皿法，測定制備好的菌液的菌數(shù)（cfu/ml），所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同3.3.1，結(jié)果見附表2。

3.3.3 供試品對照組

取1∶10的供試液1ml，等量分注于5個平皿中，每皿0.2ml，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后置30℃～35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，測定其本底的細(xì)菌數(shù)。

取1∶10的供試液1ml，注入平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后置23℃～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，測定其本底的霉菌及酵母菌數(shù)。結(jié)果見附表3。

3.3.4 回收率

附表1 試驗(yàn)組菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）

附表2 菌液組菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）

附表3 供試品對照組菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）

附表4 回收率（%）

附表5 大腸埃希菌檢查結(jié)果

分別進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)，結(jié)果見附表4。

結(jié)果顯示，各試驗(yàn)菌的回收率均大于70%，表明該方法可以有效地減弱本品對試驗(yàn)菌的抑制作用。

3.4 大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證

3.4.1 供試品組

取1∶10供試液10ml，加至100ml乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置30℃～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

3.4.2 空白對照組

取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，加至100ml乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置30℃～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

3.4.3 試驗(yàn)組

取1∶10供試液10ml，加至100ml乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，再加入1ml大腸埃希菌菌液，置30℃～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

分別取上述培養(yǎng)物0.2ml，加至含5ml4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基試管中，置30℃～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～24h，觀察結(jié)果。見附表5。

結(jié)果顯示，試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌，供試品組和空白對照組結(jié)果為陰性，說明該方法檢查大腸埃希菌可行。

綜上所述，草案擬定的方法可行。

4 確定的微生物限度檢查方法[6][7]

取本品10 g，加p H 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液；細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10的供試液1ml，等量分注于5個平皿中，每皿0.2ml；霉菌及酵母菌數(shù)采用平皿法，取1∶10的供試液1ml，注入平皿中，每皿1ml；大腸埃希菌采用常規(guī)法。

5 討論

由于中成藥的成分復(fù)雜，常有抑菌性，如果不對微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，只采用平皿法，會使結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差。因此要采取適當(dāng)?shù)姆椒p弱供試液的抑菌性，同時對方法進(jìn)行驗(yàn)證，才能確保結(jié)果的可靠性。如何減弱抑菌性，在方法的選擇上可以優(yōu)先考慮稀釋法，簡單可靠。離心沉淀法較為繁瑣且有局限性，故未采用。

本品供試液不能全部透過濾膜，薄膜上表面有較多殘留，不適合薄膜過濾法。本品抑菌成分復(fù)雜，也很難采用中和法。因此優(yōu)先選擇培養(yǎng)基稀釋法，驗(yàn)證的結(jié)果表明，此方法可有效消除連花清瘟顆粒的抑菌性，使微生物限度檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠[2][3][5]。