油菜素內(nèi)酯基因BAS1根系表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

束紅梅 郭書巧 鞏元勇 倪萬潮

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室，南京 210014）

油菜素內(nèi)酯基因BAS1根系表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

束紅梅 郭書巧 鞏元勇 倪萬潮

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室，南京 210014）

為使油菜素內(nèi)酯基因BAS1在根系特異表達(dá)。首先構(gòu)建含有根系啟動子TobRB7的根系表達(dá)載體pCAMBIA2301-RB7-rbc。再將獲得的油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1與其整合，得到BAS1基因的根系特異表達(dá)載體pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc，通過農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)入煙草。經(jīng)PCR和RT-PCR驗證，目的基因BAS1已成功轉(zhuǎn)入煙草，并在根系表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中根系油菜素內(nèi)酯受體激酶基因BRI1的表達(dá)受到影響。

BAS1基因；根系表達(dá)載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因植株；表達(dá)

油菜素內(nèi)酯是一類甾醇類激素，其在植物的生長發(fā)育及耐逆性方面起著重要作用［1-3］。研究表明，鹽堿、干旱等逆境脅迫條件下外施油菜素內(nèi)酯可提高植物的耐逆性［4，5］。但植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯水平的高低主要是通過原位油菜素內(nèi)酯代謝相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控［6］。BAS1基因編碼一個細(xì)胞色素P450（CYP72B1），過量表達(dá)導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯C-26羥基羥化，但C-26羥化后的油菜素內(nèi)酯生物活性遠(yuǎn)低于正常油菜素內(nèi)酯［7，8］，因此BAS1作為C-26-羥化酶，是一個重要的油菜素內(nèi)酯失活基因［7，9，10］，影響植物體內(nèi)活性油菜素內(nèi)酯含量。

作物根系是植株的支柱，是作物吸收養(yǎng)分和水分的主要器官，還是鹽堿、干旱等逆境脅迫首先作用的器官，逆境通過影響根系生理功能從而影響植株地上部的生長發(fā)育乃至產(chǎn)量形成［11，12］。但由于根系生長的特殊性及研究技術(shù)手段的局限，目前關(guān)于根系對逆境的響應(yīng)以及根系的改良研究較少，關(guān)于根系油菜素內(nèi)酯基因BAS1在逆境調(diào)控中的作用尚未見報道。為此，本研究利用煙草根組織特異性表達(dá)基因TobRB7啟動子［13，14］構(gòu)建油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1的根系特異表達(dá)載體，旨在為研究油菜素內(nèi)酯基因BAS1的功能奠定基礎(chǔ)，并為作物耐逆改良提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子、載體和菌株 煙草、擬南芥種子和pCAMBIA2301，大腸桿菌DH5α以及農(nóng)桿菌菌株EHA105為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶是TaKaRa公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒是AXYGEN產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 TobRB7基因啟動子的克隆及根系表達(dá)載體的構(gòu)建 以煙草為材料，用CTAB法提取DNA并以其為模板，從公布的煙草基因組數(shù)據(jù)庫中TobRB7基因（GenBank No. S45406）啟動子區(qū)域設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增TobRB7啟動子序列。在引物兩端分別引入EcoR I和Sac I酶切位點，引物序列如下：TobRB7-F1：5'-GGAATTCGGCATACTTTTAGAATG CGT-3'；TobRB7-R1：5'-CGAGCTCTTCTCACTAGA AAAATGCCC-3'。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；再72℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc在37℃條件下分別用EcoR I、Sac I雙酶切3 h，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收892 bp的TobRB7的啟動子序列和12 kb的質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc酶切后的大片段，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取在卡那霉素（Kan）抗性平板上長出的單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2 BAS1基因的克隆 以野生型擬南芥植株為材料，用Trozol提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。根據(jù)已報道擬南芥BAS1基因（GenBank No. NM_128228.3）mRNA序列設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增BAS1編碼區(qū)的全長片段。在引物兩端分別引入Xba I和Kpn I酶切位點，引物序列如下：BAS1-F1： 5'-TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGCAAAG-3'；BAS1-R1：5'-CGGGGTACCTTCCAAGTCCGGAACA AA-3'。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；再72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pTG19-T載體上，并送至Invitrogen公司測序。用于構(gòu)建BAS1基因的根系表達(dá)載體。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的檢測 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Rif和Kan抗性平板上生長的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。將含有重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌采用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，對當(dāng)代轉(zhuǎn)基因植株（T0代）進(jìn)行PCR檢測。采用CTAB法小量提取煙草基因組DNA，以BAS1基因引物BAS1-F2：5'-AAGAAACCAAACTCGCAAAG-3'和BAS1-R2：5'-TTCCAAGTCCGGAACAAA-3'檢測轉(zhuǎn)基因植株。

收獲后對T1代種子在含有Kan的MS培養(yǎng)基上篩選陽性苗，并進(jìn)行RT-PCR分析。用Trozol提取煙草的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。對轉(zhuǎn)基因植株BAS1基因進(jìn)行表達(dá)分析，引物為BAS1-F3：5'-ACGGTGAAGTTGAGGTAGA-3'和 BAS1-R3：5'-AACATAAGGACGGTAGGTG-3'，BRI1基因（GenBank No. EF623823）的引物為BRI1-F1：5'-GAGGGATTAGACAGGAACAG-3'和 BRI1-R1：5'-CAGGAATAGGTCCAGTGAGA-3'。以actin基因（GenBank No. EU938079）為內(nèi)部參照基因（469 bp），引物為actin-F：5'-CCTCTTAACCCGAAGGCTAA-3'，actin-R：5'-GAAGGTTGGAAAAGGACTTC-3'。

2 結(jié)果

2.1 TobRB7啟動子的植物根系特異表達(dá)載體的構(gòu)建

通過PCR擴(kuò)增獲得的TobRB7基因啟動子片段與質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc重組，獲得的根系表達(dá)載體命名為pCAMBIA2301-RB7-rbc。對重組質(zhì)粒酶切出現(xiàn)890 bp左右的目的條帶（圖1），說明啟動子片段與質(zhì)粒重組成功。

2.2 BAS1基因編碼區(qū)全長的克隆及其根系表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)BAS1基因序列的開放閱讀框（ORF）獲得目的片段，通過核苷酸測序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增獲得的基因片段全長為1 790 bp。將帶有酶切位點的BAS1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pCAMBIA2301-RB7-rbc在37℃條件下分別用KpnⅠ、XbaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，進(jìn)行酶切鑒定。酶切結(jié)果（圖2）顯示，重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切得到兩條帶的長度分別與pCAMBIA2301-RB7-rbc載體和BAS1基因的長度一致，說明油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc構(gòu)建成功。

圖1 pCAMBIA2301-RB7-rbc酶切鑒定

2.3 轉(zhuǎn)基因植株鑒定及BAS1基因在煙草中的表達(dá)

對轉(zhuǎn)基因植株（T0代）進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果（圖3）顯示有10棵T0代轉(zhuǎn)基因苗擴(kuò)增出了1 790 bp的條帶，表明油菜素內(nèi)酯基因BAS1已整合到煙草基因組中。轉(zhuǎn)基因植株生長狀況（圖4）顯示，BAS1組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)矮化，但是根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草生長正常。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR分析

T1代轉(zhuǎn)基因植株收獲得到的種子在含有Kan的MS培養(yǎng)基上篩選陽性苗，并進(jìn)行表達(dá)分析。BAS1基因的表達(dá)結(jié)果（圖5）表明，在未轉(zhuǎn)基因植株中沒有檢測到目的基因，組成型過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中BAS1基因在根系、葉片均有表達(dá)，而根系特異表達(dá)載體使BAS1基因僅在根系特異表達(dá)，在葉中基本不表達(dá)。進(jìn)一步分析油菜素內(nèi)酯受體激酶基因BRI1的表達(dá)情況，相較于未轉(zhuǎn)基因植株，組成型表達(dá)BAS1的轉(zhuǎn)基因植株中BRI1基因的表達(dá)量下降，根系特異表達(dá)BAS1的轉(zhuǎn)基因植株BRI1基因的表達(dá)量也下降，但在葉片中下降幅度較小。

3 討論

油菜素內(nèi)酯在植物生長發(fā)育及耐逆響應(yīng)中起作用，前人通過對油菜素內(nèi)酯合成途徑的相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，多個基因參與耐逆調(diào)控［15-17］。Zeng等［15］通過對油菜素內(nèi)酯det2突變體的耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，相較于野生型擬南芥品種，det2突變體對鹽分更為敏感，外施油菜素內(nèi)酯可以提高det2突變體的耐鹽性。過量表達(dá)DWF4可提高種子的萌發(fā)和幼苗抗低溫能力［17］。說明油菜素內(nèi)酯合成基因det2、DWF4可以調(diào)控植物耐逆性。但植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯含量除了取決于合成途徑基因，還與降解失活途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)［18，19］。目前對植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯的降解失活途徑研究還不夠系統(tǒng)，只鑒定出少數(shù)幾個基因［7-9］。BAS1基因作為油菜素內(nèi)酯失活基因，其過量表達(dá)影響植株表型，但關(guān)于該基因是否參與植物耐逆性調(diào)控尚未明確。因此BAS1基因表達(dá)載體的構(gòu)建為研究BAS1基因在耐逆調(diào)控方面的功能奠定基礎(chǔ)。

根系是受鹽堿、干旱脅迫的直接器官，并且油菜素內(nèi)酯不同于其他植物激素，其在植物體內(nèi)不能進(jìn)行長距離運輸，只在合成部位起作用［6］。因此為了解逆境下BAS1基因在根系中的作用，構(gòu)建BAS1基因的根系表達(dá)載體是十分必要的。為使基因在根系高效表達(dá)，根系啟動子的選擇是一個重要方面。目前在植物中獲得了一批根系特異啟動子［20，21］，本研究選用煙草根組織特異性表達(dá)基因TobRB7啟動子構(gòu)建根系特異表達(dá)載體。TobRB7基因已知啟動子區(qū)段長為1 878 bp，且在-823-+70 bp區(qū)域該啟動子正反方向插入均表現(xiàn)出較強的根組織特異性表達(dá)調(diào)控功能［11，12］。將BAS1基因與其整合獲得含有BAS1基因的根系表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果看出構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc使BAS1基因在煙草根系特異表達(dá)。并且從油菜素內(nèi)酯信號途徑基因的表達(dá)結(jié)果看出，外源BAS1基因的導(dǎo)入影響轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源油菜素內(nèi)酯受體激酶基因BRI1的表達(dá)，但根系特異表達(dá)BAS1的轉(zhuǎn)基因植株主要是根系相關(guān)基因的表達(dá)受到影響。說明獲得的BAS1根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株雖然地上部表型沒受影響，但根系油菜素內(nèi)酯信號基因的表達(dá)受到影響，因此為了解BAS1基因在根系的功能，還需對該轉(zhuǎn)基因植株的生理變化以及耐逆響應(yīng)進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本實驗基于根系是鹽堿、干旱脅迫的首要器官以及油菜素內(nèi)酯在耐逆調(diào)控中的作用，利用克隆分離到的油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1以及根系特異啟動子，構(gòu)建BAS1根系表達(dá)載體，并將重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入煙草中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)PCR 鑒定pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc表達(dá)載體已成功整合到煙草基因組中。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction of Root Expression Vector of Brassinosteroid Gene BAS1 and Genetic Transformation into Tobacco

Shu Hongmei Guo Shuqiao Gong Yuanyong Ni Wanchao
（Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Cotton and Rapeseed of Ministry of Agriculture，Nanjing 210014）

In order to allow brassinosteroid gene BAS1 overexpress in root， the root expression vector pCAMBIA2301-RB7-rbc with root promoter TobRB7 was constructed. Then inactivated gene BAS1 was integrated into the root overexpression vector pCAMBIA2301-RB7-BAS1-rbc， and they were transformed into tobacco by Agrobactrium tumefaciems infection. With the verification by PCR and RT-PCR， the target gene BAS1 was transformed into tobacco genome successfully， and expressed in root；the expression of brassinosteroid receptor kinase gene BRI1 in roots of transgenic plants was affected.

BAS1 gene；construction of root expression vector；transgenic plants；expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.015

2014-11-01

國家自然科學(xué)基金項目（31201139），國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ棧?011ZX08005-001），江蘇省自主創(chuàng)新基金項目［CX（14）2065］

束紅梅，女，博士，副研究員，研究方向：作物基因功能和耐逆生理；E-mail：shuhm1982@163.com

倪萬潮，男，碩士，研究員，研究方向：作物基因技術(shù)；E-mail：nwchao2002@aliyun.com