RANTES在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型中的作用研究

太原化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司職工醫(yī)院（030021）王貴英

子宮內(nèi)膜異位癥是子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在機體子宮腔以外的其他部位的一種疾病，高發(fā)于25～45歲女性，發(fā)病率約占育齡期婦女的10%～15%[1]。子宮內(nèi)膜異位癥的臨床表現(xiàn)多種多樣，主要癥狀為繼發(fā)性痛經(jīng)，并隨疾病的進(jìn)展而漸進(jìn)性加重，嚴(yán)重影響婦女的身心健康。目前，臨床上采用藥物和手術(shù)兩種方法治療子宮內(nèi)膜異位癥。但迄今為止，除了切除子宮根治手術(shù)外，還沒有一種理想治療子宮內(nèi)膜異位癥的方法，無論是藥物治療還是保守性手術(shù)均有高達(dá)50%以上的復(fù)發(fā)率。因此，尋找治療子宮內(nèi)膜異位癥安全、有效的方法是目前子宮內(nèi)膜異位癥研究的重點。

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制至今仍未完全闡明。自從1860年Von Rokitansky首次對子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)行闡述后，眾多關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制學(xué)說紛紛出現(xiàn)。1925年Sampson發(fā)表經(jīng)血逆流學(xué)說[2]，提出脫落的子宮內(nèi)膜碎片隨經(jīng)血逆流至腹腔后，發(fā)生種植，并在局部生長。問題是經(jīng)血逆流是育齡期婦女一種常見生理現(xiàn)象，但是僅有約10%～15%的婦女患子宮內(nèi)膜異位癥。有學(xué)者表明[3]，內(nèi)膜發(fā)生種植與生長要完成粘附、侵襲和血管形成三個步驟。由此可見，子宮內(nèi)膜種植只是發(fā)病的原因之一，尚有其他發(fā)病機制在發(fā)病過程起作用。近年來，炎性反應(yīng)在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中的作用成為眾多學(xué)者的研究熱點。RANTES是一種由正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子，參與了大量的炎性反應(yīng)過程。有研究報道，RANTES與內(nèi)異癥有著密切的關(guān)系，因此對RANTES的干預(yù)可能成為治療子宮內(nèi)膜異位癥的新想法。PDTC是一種NF-ΚB抑制劑，它可以抑制炎性反應(yīng)中的信號傳導(dǎo)樞紐—NF-ΚB通路的表達(dá)，從而抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展。本文將通過研究RANTES在大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型中的發(fā)達(dá)，及PDTC對其產(chǎn)生的作用，探討RANTES在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中起到的作用。

附表1 干預(yù)前兩組異位灶體積

附表2 干預(yù)4周、8周后兩組內(nèi)膜異位灶體積

附表3 干預(yù)后兩組大鼠血清中RANTES濃度的比較

附圖1 大鼠動情期顯微鏡成像

附圖2 手術(shù)自體移植法造模過程

附圖3 造模成功標(biāo)準(zhǔn)

1 動物模型的構(gòu)建

1.1 實驗動物 選取健康雌性SD大鼠50只，周齡8～10周，體重200～250g。給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期，按需添加標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，定期更換墊料保持鼠籠清潔干燥。室內(nèi)溫度保持20℃，濕度40%～50%。

1.2 SD大鼠動情期的確定 用無菌棉簽插入大鼠陰道內(nèi)，旋轉(zhuǎn)棉拭子3～4圈，取出進(jìn)行涂片，利用光學(xué)顯微鏡觀察分泌物的細(xì)胞形態(tài)。大鼠動情期時可見大量無核角化細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞。選擇監(jiān)測有連續(xù)3個動情期的大鼠進(jìn)行造模。（見附圖1）

1.3 大鼠內(nèi)異癥模型建立 給予大鼠1 0%的水合氯醛0.4ml/kg腹腔麻醉。麻妥后，將大鼠固定于動物實驗臺上。于尿道口上方1cm處打開腹腔。進(jìn)入腹腔后，充分暴露子宮，取右側(cè)子宮近端離右側(cè)子宮角1cm處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢1cm處結(jié)扎。剪下中間段子宮后，行子宮段斷吻合術(shù)。分離離斷的子宮內(nèi)膜及肌層。將其修剪成一塊約3mm×3mm大小的子宮內(nèi)膜組織，將內(nèi)膜面朝向腹腔，并固定在切口左側(cè)腹壁處，以無損傷棉線固定。每只大鼠注射25萬單位青霉素鈉。查無出血后，用絲線分層縫合腹部切口。大鼠分籠安放，待其自然蘇醒，常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)3天給予肌肉注射青霉素鈉，25萬單位/只。保持鼠籠干燥清潔。（見附圖2）

1.4 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 肉眼可見移植物體積增大，呈小泡狀的透明結(jié)節(jié)或囊腫，囊內(nèi)可見黃色或透亮漿液，移植物有新生血管生成，被結(jié)締組織覆蓋。切取移植物送病檢。病理診斷證實為子宮內(nèi)膜異位癥即造模成功。（見附圖3）

2 實驗方法

2.1 實驗對象分組 將造模成功的40只大鼠采用隨機分組的方法分為兩組，分別為：對照組和PDTC組。計算內(nèi)異灶體積=0.52×長×寬×高[4]（見附表1）。各組內(nèi)異灶體積比較P＞0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。測量后給予對照組常規(guī)飼養(yǎng)。PDTC組給予PDTC100mg/kg/d，持續(xù)8周。

2.2 取材 應(yīng)用酒精棉球擦拭鼠尾。用5號頭皮針穿刺大鼠尾部，抽出注射器活塞，制造負(fù)壓進(jìn)行取血。取血結(jié)束后，應(yīng)用脫脂棉球按壓針眼部位30s，確定止血后放開大鼠[5]。切取大鼠異位病灶阻滯，用生理鹽水清洗，放入液氮保存。

2.3 ELISA方法測定血清中RANTES含量 所取大鼠尾靜脈血置于無菌采血管中，放置1～2 小時后離心(1000 轉(zhuǎn)/分鐘)10min，吸取血清置于-2 0 ℃冰箱保存。選用RANTES ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）進(jìn)行血清RANTES的測定。所有OD 值減除空白值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品之OD 值在半對數(shù)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品的OD 值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)RANTES含量。

2.4 R T-P C R 方法測定大鼠異位灶中RANTES的含量

2.4.1 RNA引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank NCBI發(fā)表的RANTES全長cDNA序列，采用Primer premier5.0軟件設(shè)計大鼠RANTES引物。RANTES上游引物為：5′-CCATATGGCTCGGACACCA-3′，下游引物為5′-GCTCATCTCCAAATAGTTG-3'，擴增產(chǎn)物長度為2 2 1 b p。內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的上游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，擴增產(chǎn)物長度為480bp。

2.4.2 實驗步驟 取出標(biāo)本，稱重后加入1mlRNAiso Plus裂解細(xì)胞，充分裂解后轉(zhuǎn)移至EP管，室溫靜置。5min后加入200μl三氯甲烷，充分震蕩后室溫靜置。5min后在12000rpm，4℃條件下離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至EP管，加入等體積異丙醇搖勻，室溫靜置10min，再次離心5min。吸取上層乙醇，注意不要觸及RNA。干燥后加入DEPC水溶解RNA。

2.4.3 提取RNA純度測定 取1μl以上步驟提取的RNA，加入99μlTBE，用分光光度計測OD260和OD280數(shù)值。提取RNA純度= OD260/OD280。純度在1.7～2.0表示轉(zhuǎn)錄要求。

2.4.4 PCR擴增 將提取RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增方案為：逆轉(zhuǎn)錄cDNA，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Dntp Mixture，2.0μl；TaKaRa Taq，0.25μl；上游引物，1.0μl；下游引物，1.0μl。用去離子水定容至25μl。

2.4.5 PCR產(chǎn)物電泳 取0.7g 2%瓊脂糖凝膠，放入燒杯中，加入35ml 0.5×TBE緩沖液。在微波爐中加熱至瓊脂糖融化后取出，搖勻冷卻，60℃時緩慢導(dǎo)入放有梳子的玻璃槽，注意不要有氣泡的出現(xiàn)。靜置30min后取出梳子。將凝好的瓊脂凝膠放入電泳槽，加入0.5×TBS緩沖液直至沒過凝膠表面。加入樣品與DNA Marker，進(jìn)行電泳。結(jié)束后，在EB溶液中染色，用紫外燈顯像、拍攝。用光密度與GAPDH的作為半定量標(biāo)準(zhǔn)。

3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多個獨立樣本兩兩均數(shù)之間的比較采用SNK-Q檢驗，P＜0.05，表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 內(nèi)異灶體積的變化 隨著時間的延長，對照組內(nèi)異灶體積逐漸增大，PDTC組內(nèi)異灶體積逐漸縮小，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PDTC組第4周、第8周的內(nèi)異灶體積均明顯小于對照組，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）見附表2。

4.2 用ELISA 法檢測治療后各組大鼠血清中RANTES的含量 對照組第8周血清RANTES含量明顯高于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PDTC組第8周血清RANTES含量明顯低于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PDTC組第4 周、第8周大鼠血清中RANTES的水平均明顯低于對照組，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（見附表3）

4.3 R T-P C R 方法測定大鼠異位灶中RANTES的含量 對照組第8周內(nèi)異灶RANTES含量明顯高于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PDTC組第8周內(nèi)異灶RANTES含量明顯低于第4周，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。P D T C 組第4 周、第8 周大鼠內(nèi)異灶中RANTES的水平均明顯低于對照組，其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（見附圖4）

5 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見疾病，其獨有的痛經(jīng)、慢性盆腔痛以及導(dǎo)致的不孕，嚴(yán)重影響育齡期婦女的健康和生活質(zhì)量。RANTES（regulated upon activation normal T expression and secretion）, 是一種由正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子，1996年Oral等指出RANTES參與子宮內(nèi)膜異位癥的炎癥反應(yīng)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠的血清、內(nèi)異灶中RANTES的含量明顯增高。由此我們推斷RANTES參與了子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展的病理過程。另外還發(fā)現(xiàn)，如果無藥物的干預(yù)，血清和內(nèi)異灶中RANTES濃度逐漸增加，預(yù)示著RANTES可能是反應(yīng)該疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。因此，RANTES的測定很可能成為臨床上子宮內(nèi)膜異位癥治療、評估的一個新方向。

附圖4 RT-PCR對異位灶中RANTES的測量結(jié)果

核因子ΚB(nuclear factor kappa—B，NF-ΚB)是一種多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，其作為信號傳導(dǎo)途徑中的樞紐，參與了眾多炎性反應(yīng)過程。其中RANTES趨化因子既是NF-ΚB傳導(dǎo)通路中的一員。本研究中發(fā)現(xiàn)，NF-ΚB抑制劑PDTC可以抑制大鼠內(nèi)異癥模型血清和內(nèi)異灶中RANTES的含量。說明PDTC治療大鼠內(nèi)異灶模型有效，并且成功的干預(yù)了RANTES的表達(dá)分泌。

綜上所述，RANTES參與了大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展。NF-ΚB抑制劑PDTC可以抑制子宮內(nèi)膜異位灶的生長及血清、內(nèi)異灶RANTES的分泌。具有可觀的臨床應(yīng)用前景。