保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)人肝癌Huh-7細(xì)胞的作用及機(jī)制研究

阿南達(dá)　蘇依拉其木格　包景榮　蘇秀蘭

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市伊金霍洛旗蒙醫(yī)院蒙醫(yī)肝膽內(nèi)科，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017200；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；3.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院制劑中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020

保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)人肝癌Huh-7細(xì)胞的作用及機(jī)制研究

阿南達(dá)1蘇依拉其木格2包景榮3蘇秀蘭2

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市伊金霍洛旗蒙醫(yī)院蒙醫(yī)肝膽內(nèi)科，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017200；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；3.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院制劑中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020

目的探討保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)人肝癌Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用與推廣提供科學(xué)的理論及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法體外培養(yǎng)人肝癌Huh-7細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為四組：對(duì)照組（生理鹽水）、保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組、5-氟尿嘧啶（5-Fu）組、保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組。分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Q-PCR技術(shù)觀察藥物干涉后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果5-Fu組、保肝蒙藥Ⅰ號(hào)（4 mg/mL）組和保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組對(duì)Huh-7肝癌細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到67.70%、73.67%和75.35%。保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組單獨(dú)作用于Huh-7肝癌細(xì)胞以及保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組聯(lián)合作用，細(xì)胞的凋亡率均顯示增加（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組和5-Fu組分別作用于Huh-7肝癌細(xì)胞后顯示細(xì)胞G0/G1期比率明顯增加（P＜0.05）；然而，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組作用于Huh-7肝癌細(xì)胞后顯示細(xì)胞S期比率明顯增加（P＜0.05）。保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組對(duì)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)具有調(diào)控作用，能上調(diào)細(xì)胞色素C的表達(dá)。結(jié)論保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)人肝癌Huh-7細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，其機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯及影響腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)。研究成果將對(duì)闡明臨床應(yīng)用的保肝蒙藥Ⅰ號(hào)治療肝癌的機(jī)制及推廣應(yīng)用有重要意義。

保肝蒙藥Ⅰ號(hào)；肝癌Huh-7細(xì)胞；5-氟尿嘧啶

蒙醫(yī)藥作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)已經(jīng)在臨床疾病的預(yù)防與治療中顯示出其獨(dú)特的作用。但是，目前臨床應(yīng)用的多數(shù)蒙藥的藥理作用機(jī)制尚未開展研究，僅憑藥典、經(jīng)驗(yàn)使用，缺少科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。利用現(xiàn)代的細(xì)胞與分子生物學(xué)理論與方法闡明蒙藥作用機(jī)制，是實(shí)現(xiàn)蒙藥現(xiàn)代化，進(jìn)行蒙藥研發(fā)、推廣應(yīng)用的重要途徑，是當(dāng)前蒙藥方劑研究中一個(gè)新興的課題。

盡管保肝蒙藥Ⅰ號(hào)在臨床應(yīng)用中已經(jīng)呈現(xiàn)出較好的治療肝癌的作用，但是，迄今為止其機(jī)制尚不清楚。根據(jù)保肝蒙藥Ⅰ號(hào)的臨床有效應(yīng)用，筆者提出科學(xué)假設(shè)，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)可能通過影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡過程抑制肝癌細(xì)胞增殖，其藥理作用機(jī)制可能與影響凋亡途徑中一些關(guān)鍵基因的表達(dá)相關(guān)。本文首次利用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)展開研究，為保肝蒙藥Ⅰ號(hào)的深入研究及臨床推廣應(yīng)用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Huh-7細(xì)胞由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心提供，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，每3～4天傳代。DMEM，胰蛋白酶和滅活的胎牛血清均為Hyclon公司產(chǎn)品。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。Annexin V/ PI雙染法流式細(xì)胞分析試劑盒及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑均購自美國Becton-Dickinson公司。Caspase-3 P20（N-19）（產(chǎn)品編號(hào)：SC-1226）、Caspase-8 P18（D-8）（產(chǎn)品編號(hào)：SC-5263）、Caspase-9（9CSP03）（產(chǎn)品編號(hào)：SC-73548）和Cytochrome C（A-8）（產(chǎn)品編號(hào)：SC-13156）均購自于圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。RTPCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 MTT法測(cè)定蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖抑制作用

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，以4×103細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的保肝蒙藥Ⅰ號(hào)、5-Fu、對(duì)照組（用等量的生理鹽水）和保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（采用藥物減半培養(yǎng)）。培養(yǎng)24 h后每孔加20 μL濃度為5 mg/mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，再加150 μL的DMSO，振蕩10 min，使甲瓚充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度（A）值，每個(gè)藥物濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其平均值，各組選擇半數(shù)致死量（IC50）的濃度進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。按下列公式計(jì)算平均細(xì)胞抑制率（IR）：IR=（對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值× 100%［1-2］，計(jì)算各孔平均值。

1.3 HE染色

細(xì)胞接種于載玻片，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行藥物干預(yù)，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組、蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組和5-Fu組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)，并用90%乙醇固定1 h，進(jìn)行HE染色，采集圖像。

1.4流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

將Huh-7細(xì)胞接種于6孔板，1×104細(xì)胞/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，實(shí)驗(yàn)各組藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，常規(guī)0.25%胰酶消化細(xì)胞，充分吹打，制成單細(xì)胞懸液；離心半徑18 cm，1000 r/min離心5 min后，棄上清液，PBS充分洗滌；再次1000 r/min離心5 min，逐滴加入70%冰乙醇，邊加邊振蕩，使細(xì)胞充分分散，固定后將樣品放入-20℃冰箱內(nèi)保存；上機(jī)前取出固定的細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加PBS 1 mL，充分洗滌細(xì)胞，使之成為單細(xì)胞懸液；1000 r/min離心5 min，棄上清液；加入Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106細(xì)胞/mL；再加入5 μL Annexin V-FITC和20 μL Propidium Iodide，混勻；室溫避光，反應(yīng)15 min；在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。離心收集檢測(cè)細(xì)胞周期的細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞3次，加入15 μL 100 μg/mL的RNase，振蕩混合均勻，4℃避光放置15 min，加入PI，含50 μg/mL PBS，總量500 μL，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況［3］。

1.5 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)蒙藥對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

反轉(zhuǎn)錄體系組成由2 μL的Template RNA，1 μL的oligo（dT）primer和9 μL的RNase-free water組成。65℃條件下反應(yīng)5 min后加入4 μL的RT Buffer溶液，1 μL的Ribolock，10 mmol/L的dNTP Mix和2 μL的RevertAid RT。PCR反應(yīng)體系由5 μL的Mix、0.3 μL的上游引物、0.3 μL的下游引物、0.02 μL的Rox、3.88 μL的RNase-free water和0.5 μL的cDNA組成。擴(kuò)增目的基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，以actin為內(nèi)參，合成引物及擴(kuò)增片段大小如下所述。引物：Caspase-3：Forward 5'-h-cas3-F：AGA ACT GGA CTG TGG CAT TGA G；Reverse 5'-GCT TGT CGG CAT ACT GTT TCA；擴(kuò)增片段為191 bp。Caspase-8：Forward 5'-GGA TGG CCA CTG TGA ATA ACT G；Reverse 5'-TCG AGG ACA TCG CTC TCT CA；擴(kuò)增片段為101 bp。Caspase-9：Forward 5'-GTC CTA CTC TAC TTT CCC AGG TTT TG；Reverse 5'-GTG AGC CCA CTG CTC AAA GAT；擴(kuò)增片段為100 bp。Cyt-C：Forward 5'-GAG CGG GAG TGT TCG TTG T；Reverse 5'-：CTT CCG CCC AAA GAG ACC AT；擴(kuò)增片段為165 bp。actin：Forward 5'-CAGC CTC AAGATCATCAGCA；Reverse 5'-TG TGG TCATG AG TCCTTCCA；擴(kuò)增片段為452 bp。分別檢測(cè)各組actin、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C的表達(dá)量，每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)檢測(cè)3次。Real time-PCR反應(yīng)體系如下所示：5 μL的2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix，0.3 μL的Primer A，0.3 μL的Primer B，0.5 μL的cDNA，3.88 μL的RNase-free water和0.02 μL的Rox。反應(yīng)條件為95℃條件下PCR初始熱激活持續(xù)5 min，經(jīng)過兩步循環(huán)后，在95℃指示10 s，經(jīng)60℃下伸展30 s，再循環(huán)40 s完成。采用比較法（△△CT）計(jì)算各組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C相對(duì)定量，并用2-△△CT來比較各組基因mRNA表達(dá)情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述與統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多組間的比較采用單因素方差分析或多個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

保肝蒙藥Ⅰ號(hào)及聯(lián)合化療藥物作用于人肝癌細(xì)胞Huh-7，與未治療組比較，各組均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用，見表1。

2.2 HE染色病理學(xué)分析

與對(duì)照組比較，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組及保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組作用于Huh-7細(xì)胞后，細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，與周圍的細(xì)胞脫離，核質(zhì)濃縮。5-Fu組單獨(dú)用藥未見明顯凋亡現(xiàn)象。保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組對(duì)Huh-7細(xì)胞具有較好的增殖抑制作用。見圖1。

表1　各組藥物對(duì)人肝癌Huh-7細(xì)胞的抑制作用（n=3）

圖1　不同藥物對(duì)Huh-7細(xì)胞的HE染色圖（400×）

2.3流式細(xì)胞術(shù)分析保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

對(duì)照組與5-Fu組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組及5-Fu組（P＜0.05），且保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組細(xì)胞凋亡率顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組（P＜0.05）。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組細(xì)胞G0/G1期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），5-Fu組與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組細(xì)胞G0/G1期顯著高于對(duì)照組及保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（P＜0.05），5-Fu組細(xì)胞G0/G1期顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組（P＜0.05）；保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組細(xì)胞S期顯著高于5-Fu組（P＜0.05），對(duì)照組細(xì)胞S期顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組（P＜0.05），保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組細(xì)胞S期顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；對(duì)照組及5-Fu組細(xì)胞G2/M期顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（P＜0.05）。見表2。

表2　FCM檢測(cè)保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)Huh-7細(xì)胞凋亡和周期的影響（48 h）（%，）

表2　FCM檢測(cè)保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)Huh-7細(xì)胞凋亡和周期的影響（48 h）（%，）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與5-Fu組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別凋亡率G0/G1期S期G2/M期對(duì)照組5-Fu組保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組0.39±0.03 0.48±0.09 1.15±0.17**##1.46±0.14**##△48.77±4.16 64.83±0.31**57.15±3.71*#42.10±5.59##△△37.13±1.89 18.33±0.84**31.06±3.73*##52.57±3.45**##△△14.11±4.39 14.93±0.59 11.80±3.48 5.34±2.79**#

2.4 Q-PCR分析保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因表達(dá)的影響

保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組 Cyt-C基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），5-Fu組Cyt-C基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組及保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（P＜0.05），保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組Cyt-C基因的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組Caspase-3基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（P＜0.05），對(duì)照組Caspase-3基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組（P＜0.05），5-Fu組Caspase-3基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組Caspase-8基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（P＜0.05），對(duì)照組Caspase-8基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組（P＜0.05），5-Fu組Caspase-8基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組Caspase-9基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組（P＜0.05），對(duì)照組及5-Fu組Caspase-9基因的表達(dá)顯著高于保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組（P＜0.05），對(duì)照組與5-Fu組Caspase-9基因的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3　討論

盡管常規(guī)的化學(xué)療法是腫瘤的常規(guī)治療途徑，但是，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞仍然存在一定的殺傷作用，易產(chǎn)生骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等副作用，特別是產(chǎn)生的腫瘤耐藥問題成為治療失敗的重要原因之一［4-5］。尋找毒副作用小、安全、高效的腫瘤治療方法是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。中蒙藥在腫瘤的綜合治療中能顯著改善患者的生活質(zhì)量，減輕治療中產(chǎn)生的毒副作用，有延長患者生存期的作用，日益引起研究者與臨床工作者的重視。

表3　Huh-7人肝癌細(xì)胞中Cyt-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表達(dá)

表3　Huh-7人肝癌細(xì)胞中Cyt-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與5-Fu組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別Cyt-CCaspase-3Caspase-8Caspase-9對(duì)照組5-Fu組保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組1.01±0.16 91.90±36.22**1.89±0.32*##2.02±0.42**#1.01±0.21 298.94±125.31**0.47±0.02**##0.35±0.02**##△△1.085±0.531 69.584±6.563**0.025±0.012**##0.010±0.004**##△△1.0196±0.2490 0.2973±0.4827 0.0093±0.0007**#0.0044±0.0010**##△

我國肝癌的發(fā)病率目前仍未下降，依然是癌癥之王［6-7］。中國每年新發(fā)肝癌病患者30萬例，這些新發(fā)肝癌患者就診時(shí)70%～80%已屬中晚期［8-10］。開展肝癌早期診斷與綜合治療的研究，包括探索抑制肝癌細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其凋亡的藥物研究是世界范圍內(nèi)的熱點(diǎn)［11-13］。探索直接針對(duì)晚期肝癌的分子靶向藥物的研究是發(fā)展的方向和研究的熱點(diǎn)［14］。在過去的50年，幾乎47%的被批準(zhǔn)抗癌藥物為天然產(chǎn)物或其產(chǎn)物的合成分子［15］。保肝蒙藥Ⅰ號(hào)由18位天然植物組成，其君藥為訶子，而訶子由于其含有的成分豐富，具有廣泛的藥理作用，包括預(yù)防與治療腫瘤的作用［16-17］。保肝蒙藥Ⅰ號(hào)在針對(duì)晚期肝癌患者的治療中表現(xiàn)出總體生存率顯著改善的有效性，但是，目前的瓶頸是闡釋其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，在傳承的基礎(chǔ)上再探索和發(fā)展，期望保肝蒙藥驗(yàn)方成為預(yù)防與治療肝癌的有發(fā)展前景的民族藥。因此，深入研究保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)腫瘤作用的分子機(jī)制，具有重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)提示保肝蒙藥Ⅰ號(hào)（4 mg/mL）能顯著抑制人肝癌Huh-7細(xì)胞的增殖。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，生長速度快，而經(jīng)過保肝蒙藥Ⅰ號(hào)處理后，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)變圓和貼壁能力減弱的變化，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。通過MTT分析發(fā)現(xiàn)，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)在1 mg/mL的濃度時(shí)即呈現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制作用，在4 mg/mL時(shí)增殖抑制作用顯著。在減少化療藥物濃度，聯(lián)合保肝蒙藥Ⅰ號(hào)作用于人肝癌細(xì)胞系Huh-7，其增殖抑制作用明顯，且呈濃度依賴性。細(xì)胞周期阻滯研究結(jié)果顯示，細(xì)胞周期阻滯可能是導(dǎo)致Huh-7細(xì)胞存活率下降的原因之一。流式細(xì)胞術(shù)分析提示，與對(duì)照組比較，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組呈現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯變化。另一方面，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)也會(huì)影響肝癌細(xì)胞的凋亡。

半胱天冬酶（Caspase）在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用，其Caspase-8和Caspase-9分別代表線粒體上游和下游的凋亡因素，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡非常重要［18-20］。因此，筆者研究了保肝蒙藥Ⅰ號(hào)對(duì)Cyt-C、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的基因表達(dá)的影響。actin作為內(nèi)參，保肝蒙藥Ⅰ號(hào)和保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu對(duì)凋亡調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)呈上調(diào)，對(duì)Cyt-C基因的表達(dá)量增加。結(jié)果顯示保肝蒙藥Ⅰ號(hào)組對(duì)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)具有調(diào)控作用［21-23］。本研究提示Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C是保肝蒙藥Ⅰ號(hào)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，傳承保肝蒙藥Ⅰ號(hào)不但可抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而且對(duì)化療藥物有一定的減毒增敏作用，為肝癌的治療提供了新途徑，因此其有望成為一種高效低毒的抗腫瘤新藥。由于臨床應(yīng)用的化療藥物存在耐藥性以及其毒副作用，探索如何提高治療效率和減輕毒副作用制劑是世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)。本文同時(shí)探討了保肝蒙藥Ⅰ號(hào)是否可以在化療藥物治療腫瘤中減少其用量，降低毒性，同時(shí)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。結(jié)果顯示保肝蒙藥Ⅰ號(hào)聯(lián)合5-Fu組具有較強(qiáng)的增敏作用。研究結(jié)果為深入研究保肝蒙藥Ⅰ號(hào)抗腫瘤作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為蒙醫(yī)藥走向世界提供了科學(xué)的佐證。

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Study on the role and mechanism of Hepatoprotective MongolianⅠon hepatocellular carcinoma Huh-7 cells

A Nanda1Suyila Qimuge2BAO Jingrong3SU Xiulan2
1.Department of Hepatobiliary Mongolian Medicine，Ejin Horo Banner Hospital of Ordos City，Inner Mongolia Autonomous Region，Ordos017200，China；2.Clinical Medical Research Center，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Inner Mongolia Autonomous Region，Huhhot010050，China；3.Preparations Center，Inner Mongolia International Mongolian Hospital，Inner Mongolia Autonomous Region，Huhhot010020，China

Objective To explore the role and mechanism of Hepatoprotective MongoliaⅠon hepatocellular carcinoma Huh-7 cells and to provide the scientific theory and experimental data for the clinical application of Hepatoprotective MongoliaⅠ.Methods Hepatocellular carcinoma Huh-7 cells were cultured in vitro，and the experiment was divided into four groups:control group（normal saline），5-Fluorouracil（5-Fu）group，Hepatoprotective MongoliaⅠgroup and Hepatoprotective MongoliaⅠcombined with 5-Fu group.Cell proliferation was measured by MTT in Huh-7 cells. Apoptosis and cell cycle were measured by flow cytometry.Gene expression was examined by real-time fluorescence PCR.Results The proliferation inhibition rate of 5-Fu group，Hepatoprotective MongoliaⅠ（4 mg/mL）group and Hepatoprotective MongoliaⅠcombined with 5-Fu group on the Huh-7 liver cancer cell was 67.70%，73.67%and 75.35%respectively.Hepatoprotective MongoliaⅠgroup and Hepatoprotective MongoliaⅠcombined with 5-Fu group acted on the Huh-7 cell showed that the apoptosis rate was significantly increased（P＜0.05）.Compared with control group，Hepatoprotective MongoliaⅠgroup and 5-Fu group acted on the count of Huh-7 cells in G0/G1phase was significantly increased（P＜0.01），while Hepatoprotective MongoliaⅠcombined with 5-Fu group in S phase was significantly increased（P＜0.01）.QPCR data also showed that apoptosis genes，such asCaspase-3，Caspase-8 and Caspase-9 had regulatory role upon Hepatoprotective MongoliaⅠgroup and expression of cytochrome C was increased.Conclusion Hepatoprotective MongoliaⅠshows significant anti-proliferative effects on the Huh-7 cells and its inhibition mechanism involves cell cycle arrest and related gene expression，which affects tumor cell apoptosis.The research results have important significance to the application and mechanism of liver cancer treated by Hepatoprotective MongoliaⅠin explanation for clinical application.

Hepatoprotective MongoliaⅠ；Hepatocellular carcinoma Huh-7 cells；5-Fluorouracil

R965；R979.1

A

1673-7210（2015）12（b）-0026-05

2015-09-09本文編輯：張瑜杰）

內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才團(tuán)隊(duì)基金（內(nèi)組通字［2013］17號(hào)-16）。

蘇秀蘭（1956-），女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：腫瘤學(xué)及分子生物學(xué)。