三七總皂苷對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制*

陳杰，袁捷，韓祖成，曹姻莉

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西西安710003；2.西電公司西安高壓開關(guān)廠醫(yī)院，陜西西安710077）

三七總皂苷對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制*

陳杰1，袁捷1，韓祖成1，曹姻莉2

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西西安710003；2.西電公司西安高壓開關(guān)廠醫(yī)院，陜西西安710077）

目的探討三七總皂苷對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)的保護(hù)作用及作用機(jī)制。方法選取60只SD雄性大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組，線栓法建立大鼠大腦中動脈局灶缺血-再灌注損傷模型后，腹腔注射生理鹽水）、三七總皂苷組（C組，造模后，腹腔注射三七總皂苷100mg/kg），各20只。結(jié)果與A組相比，B組、C組神經(jīng)癥狀評分、腦梗死體積均明顯增高（P<0.05），依文思藍(lán)、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量均明顯提高（P<0.05）；與B組相比，C組神經(jīng)癥狀評分、腦梗死體積均明顯降低（P<0.05），依文思藍(lán)、IL-1β、TNF-α含量均明顯減少（P<0.05）。結(jié)論三七總皂苷通過降低腦部細(xì)胞因子的表達(dá)、減少血腦屏障通透性，發(fā)揮對腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦神經(jīng)保護(hù)作用。

三七總皂苷；腦缺血-再灌注損傷；大鼠；保護(hù)

腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)的治療藥物，一直是心腦血管學(xué)科研究的重點(diǎn)。大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的病理狀態(tài)與人類較相似，故模型常用于該領(lǐng)域研究［1］。三七為傳統(tǒng)活血化瘀中藥，具有散瘀止血、消腫定痛之功效，被廣泛應(yīng)用于腦血管疾病的治療［2］。三七總皂苷（PNS）作為三七的主要活性成分，不僅有抗自由基作用，還能降低血液黏度、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗動脈粥樣硬化等［3］。本研究中探討了三七總皂苷對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為臨床防治腦血管疾病提供參考，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1動物、試藥與儀器

60只SD雄性大鼠，體重260～300 g，平均（283.4±21.5）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供，合格證書號為醫(yī)動字第08-005號。三七總皂苷（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號為100706）；甲酰胺（天津外環(huán)化工公司，批號為20100912）；2%四氮唑紅（TTC，Sigma公司，批號為066K0698）；依文思藍(lán)（Fluka進(jìn)口分裝，批號為050602）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購自Sigma公司。低溫常速離心機(jī)（法國CR-412型），721型分光光度計（上海第三儀器廠）；EB-2800-22型電子天平（日本）；計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（上海醫(yī)科大學(xué)）。

1.2造模及給藥方法

栓線制備：應(yīng)用日本株式會社的尼龍線（直徑0.25 mm），剪成6.5 cm長，將前端熱塑呈光滑圓鈍狀，直徑約0.3 mm，并在距離前端1.8 cm處做好標(biāo)記。

腦缺血-再灌注損傷模型建立［4］：將60只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、三七總皂苷組（C組），各20只。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉后，仰臥位固定，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，并結(jié)扎頸外動脈及左側(cè)頸總動脈，于頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端動脈夾夾閉后，迅速在距離頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處0.5 cm的頸總動脈處做切口，插入前端圓鈍的尼龍線，插入深度約1.8 cm，造成大鼠大腦中動脈阻塞，使其形成腦缺血。于結(jié)扎入口處，尼龍線外留1 cm，縫合皮膚，術(shù)后2 h輕輕提拉外留線頭，直至略感阻力，從而造成大腦中動脈再灌注。于缺血2 h及再灌注22 h，使用電熱毯維持大鼠肛溫在37℃左右。A組分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，操作同前，但不結(jié)扎左側(cè)頸總動脈。

給藥處理：C組于缺血前15 min、缺血后6 h，經(jīng)腹腔注射給予100 mg/kg三七總皂苷，A組、B組均經(jīng)腹腔注射給予等量生理鹽水。

1.3手術(shù)處理及觀察指標(biāo)

手術(shù)中B組及C組各死亡2只，成功造模36只，A組無死亡。觀察和比較各組神經(jīng)癥狀評分、腦梗死體積，以及腦組織中依文思藍(lán)、IL-1β及TNF-α含量。

神經(jīng)癥狀評分［5］：待大鼠麻醉蘇醒后，將其放回鼠籠，術(shù)后24 h，根據(jù)5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行神經(jīng)癥狀評分，其中無神經(jīng)損傷癥狀為0分，不能完全伸展健側(cè)前爪為1分，向健側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分，向健側(cè)傾倒為3分，不能自發(fā)行走、意識喪失為4分。

腦梗死體積測定：腦缺血2 h、再灌注22 h后，斷頭取腦，將腦組織切成2mm厚度，在距離額極1，3，5，7mm處，冠狀切開大腦，在37℃下，將腦切片浸入2%四氮唑紅染色，染色30 min后取出，置入10%甲醛固定，24 h后拍照，利用圖像分析系統(tǒng)，計算梗死面積，各腦片梗死面積與厚度的乘積累加獲取梗死體積。

腦組織依文思藍(lán)含量測定：取腦前30 min，10%水合氯醛麻醉下，左心室生理鹽水灌注，直至流出液為無色，右側(cè)股靜脈注入2%依文思藍(lán)，每只約注入1mL，摘取并精確稱量腦組織濕重，投入中號試管，加入3 mL甲酰胺，45℃加蓋水浴箱孵育48 h，輕搖、離心15min（3 000 r/min），取上清，于632 nm波長下，檢測其吸光度。

IL-1β及TNF-α含量測定：術(shù)后24 h處死大鼠，冰盤上快速剝離腦組織，冷PBS緩沖液沖洗，濾紙吸干后，天子天平稱重，制成10%腦組織勻漿，4℃離心15min（4 000 r/min），取上清液，利用雙抗體夾心法，于492 nm波長下檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

結(jié)果見表1和表2。B組大鼠于缺血后2 h、再灌注22 h，均出現(xiàn)手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收、肌張力降低、肩抗力下降、向健側(cè)傾倒的偏癱癥狀。術(shù)后24 h，B組和C組大鼠出現(xiàn)不同程度的腦梗死灶。

3　討論

本研究中采用大鼠大腦中動脈缺血-再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，與A組相比，B組和C組神經(jīng)癥狀評分、腦梗死體積均明顯增高，依文思藍(lán)、IL-1β及TNF-α含量均明顯提高（P<0.05），表明缺血-再灌注損傷模型建立成功；與B組相比，三七總皂苷組神經(jīng)癥狀評分、腦梗死體積均明顯減少（P<0.05），表明三七總皂苷對缺血-再灌注損傷模型大鼠腦神經(jīng)具有保護(hù)作用。

表1　各組大鼠神經(jīng)癥狀評分及腦梗死體積比較（±s）

表1　各組大鼠神經(jīng)癥狀評分及腦梗死體積比較（±s）

注：與A組相比，*P<0.05；與B組相比，#P<0.05。下表同。

組別A組（n=20）B組（n=18）C組（n=18）劑量（mg/kg）--100神經(jīng)癥狀評分（分）0 2.7±0.8*1.6±0.5*#腦梗死體積（mm3）0 124.7±18.4*66.5±12.3*#

表2　各組大鼠腦組織中依文思藍(lán)、IL-1β及TNF-α含量比較（±s）

表2　各組大鼠腦組織中依文思藍(lán)、IL-1β及TNF-α含量比較（±s）

組別A組（n=20）B組（n=18）C組（n=18）劑量（mg/kg）--100依文思藍(lán)（μg/100mg）10.1±3.2 62.9±9.4*42.3±7.2*#IL-1β（pg/mL）37.8±6.5 56.9±9.4*37.6±7.3#TNF-α（pg/mL）54.3±7.1 90.5±9.2*56.1±8.4#

腦缺血-再灌注損傷可表現(xiàn)為腦細(xì)胞腫脹、自由基損傷等，甚至引發(fā)腦細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制目前尚不清楚［6］。血腦屏障通透性變化是腦缺-血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)［7］。依文思藍(lán)是常見的血腦屏障指示劑，能與血漿蛋白結(jié)合，正常情況下，不能通過血腦屏障，當(dāng)腦缺血-再灌注損傷時，血腦屏障的通透性發(fā)生變化，依文思藍(lán)就會通過血腦屏障，導(dǎo)致腦組織中的依文思藍(lán)含量增加［8］。本研究中，與A組相比，C組神經(jīng)癥狀評分、腦梗死體積均明顯減少，大鼠腦組織中依文思藍(lán)含量明顯降低（P<0.05）。結(jié)果表明，三七總皂苷能減少血腦屏障的通透性，從而發(fā)揮對腦神經(jīng)的保護(hù)作用。

腦缺血灶會伴有大量細(xì)胞因子表達(dá)及炎性細(xì)胞浸潤，繼而加重腦組織損傷，尤其是缺血-再灌注時更為嚴(yán)重。腦缺血后血漿及腦組織中IL-1β及TNF-α含量會出現(xiàn)急速增高，并隨著時間延長，其水平會相應(yīng)增高。IL-1β通過誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附，介導(dǎo)白細(xì)胞向缺血灶浸潤，引發(fā)炎性反應(yīng)，加重腦組織損傷［9］；IL-1β及TNF-α等細(xì)胞因子通過炎癥細(xì)胞活化，從而破壞血腦屏障的通透性；TNF-α通過對毛細(xì)血管的直接毒性作用，增加毛細(xì)血管的通透性，繼而開放血腦屏障，還可造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，與IL-1β發(fā)揮協(xié)同作用，共同破壞血腦屏障的通透性［10］。本研究中，與B組相比，C組大鼠腦組織中IL-1β及TNF-α含量均明顯減少（P<0.05），表明三七總皂苷能減少炎性細(xì)胞因子表達(dá)，降低血腦屏障的通透性，從而發(fā)揮對腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦神經(jīng)保護(hù)作用。

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Neuroprotective Role and M echanism Research of Panax Notoginseng Saponins on Cerebral Ischem ia Reperfusion Injury in Rats

Chen Jie1，Yuan Jie1，Han Zucheng1，Cao Yinli2
（1.Shaanxi Provincial Hospital of TCM，Xi′an，Shaanxi，China 710003；2.Xi′an XD High Voltage Apparatus Co.，Ltd.Hospital，Xi′an，Shaanxi，China 710077）

Objective To study the neuroprotective role and mechanism research of panax notoginseng saponins（PNS）on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.M ethods 60 male SD rats were randomly divided into the sham operation group（group A），model group（group B，ip with normal saline after ischemia reperfusion injury by ligation of middle cerebral artery）and the PNS group（group C，ip with 100 mg/kg PNS after model establishment），20 rats per group.Results Compared with the group A，the neurological deficits scores and brain infarct size in the group B and group C were significantly increased（P<0.05）；and the content of Evans blue was obviously improved in group B and group C（P<0.05）；compared with group B，the neurological deficits scores and brain infarct size were significantly decreased（P<0.05）and the contents of Evans blue，IL-1β，TNF-αwere obviously reduced in group C（P<0.05）. Conclusion PNS can play the neuroprotective role on cerebral ischemia reperfusion injury in rats by decreasing the expression of cytokines in brain tissue and reducing the permeability of blood brain barrier.

panax notoginseng saponins；cerebral ischemia reperfusion injury；rats；protection

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）24-0023-03

陳杰，男，主治中醫(yī)師，研究方向為腦血管病，（電子信箱）657292134@qq.com。

2015-08-14）

*陜西省中醫(yī)管理局科技攻關(guān)項目，項目編號：Ic86。