絲狀真菌PCR模板DNA的快速制備方法

羅中欽程琳張茜陳國華

（1.中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京　100081；2.山西師范大學生命科學學院，臨汾　041004；3.　北京師范大學生命科學學院，北京　100875）

絲狀真菌PCR模板DNA的快速制備方法

羅中欽1程琳2張茜3陳國華1

（1.中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京100081；2.山西師范大學生命科學學院，臨汾041004；3.北京師范大學生命科學學院，北京100875）

以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為材料，旨為建立沸水浴獲得PCR模板DNA的新方法?！咳∩倭空婢z置于一定體積50 mmol/L NaOH溶液中沸水浴10 min，再加入1/10體積1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液，12 000 r/min離心后，上清用作PCR的DNA模板。結果顯示，該方法擴增效率高，擴增條帶清晰，且Taq酶適應性強，適合快速制備絲狀真菌的模板DNA。該方法經濟、簡單、快速、安全高效，可用于絲狀真菌轉化子的高通量篩選和菌株的快速鑒定。

絲狀真菌；尖孢鐮刀菌；PCR擴增；Taq DNA聚合酶

PCR技術，自1983 年美國人Kary Mullis發(fā)明以來，已經成為分子生物學及其相關領域最基本、最重要的技術方法。如今，從基因擴增與基因檢測到基因克隆、基因改造、遺傳分析等都已離不開PCR技術［1，2］。另外，在病原微生物檢測、法醫(yī)鑒定、考古研究食品安全及品種鑒定等多領域PCR技術也發(fā)揮著重要作用［3-7］。

PCR方法的前提條件是獲得DNA或RNA反轉錄的cDNA模板。DNA的提取方法主要有十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）提取法［8］和十六烷基三乙基溴化銨（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）提取法［9］，或者直接從試劑公司購買提取試劑盒。這些方法雖能得到較高質量的DNA，但需樣品量較大，且操作步驟較繁瑣，效率低，難以滿足對大量樣品檢測的需求。另外，對于樣品檢測實驗需要的模板量少，常規(guī)DNA提取方法提取的大量DNA未被充分利用，造成了浪費。為解決以上問題，研究人員開發(fā)多種簡單、快速的獲得DNA模板的方法，如微量玻璃粉吸附、Chelex-100法、微波處理、TE緩沖液沸水煮、NaOH溶液處理等，通過處理植物葉片、真菌菌絲等樣品獲得模板DNA［10-16］。GE公司的Whatman FTA卡僅用一張卡片就可以完成室溫下DNA和RNA的采集、運輸、純化和儲存，為血樣、口腔細胞、植物DNA等樣本的保存和分析提供了簡單、可靠的方法［17，18］。但是，這些方法多為傳統方法的改良，程序較復雜或需要特殊的儀器、試劑或相關配套產品，因此成本較高。

對于絲狀真菌而言，遺傳轉化子篩選和野外樣本菌株鑒定往往需要對大量樣本進行PCR擴增，且所需的DNA模板量又很少，而絲狀真菌細胞壁結構復雜又無法使用普通的菌落 PCR［19，20］。因此，本研究以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為材料，結合前人研究成果，建立一種用于絲狀真菌PCR模板DNA的快速制備方法，即利用NaOH溶液對絲狀真菌的菌絲進行簡單的沸水浴處理，再加入Tris-HCl中和即可得到適用于PCR 的 DNA 模板，該方法經濟、簡單、快速、高效，旨在為絲狀真菌轉化子的高通量篩選和分離菌株的快速鑒定提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室保存的尖孢鐮刀菌甘藍?；虯8和其他絲狀真菌菌株18個。尖孢鐮刀菌和其他真菌菌株接種于含100 mg/L氨芐青霉素鈉和頭孢噻肟鈉的PDA平板上，28℃培養(yǎng)4 d，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌絲處理 取 4個1.5 mL離心管，分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，Ⅰ號離心管加入無菌水50 μL，Ⅱ號離心管加入1×TE緩沖液50 μL，Ⅲ號離心管加入100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）50 μL，Ⅳ號離心管加入50 mmol/L NaOH溶液50 μL。用無菌牙簽挑取少量菌絲到各離心管中，渦旋打散菌絲，沸水浴10 min。Ⅳ號離心管中再加入5 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液。12 000 r/min離心10 min。取上清至新離心管中，即為制備的模板DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 以1.2.1得到的DNA為模板，SDS提取法得到的100 ng/μL DNA（CK+）和無菌水（CK-）分別為陽性和陰性對照，引物選用2對真菌檢測的通用引物和10對尖孢鐮刀菌特異引物（表1）。Taq DNA聚合酶選自于5家公司：天根Taq DNA polymerase（ 貨 號：ET101-01-03）、TaKaRa Ex Taq（貨號：RR001A）、全式金 Easy Taq DNA polymerase（貨號AP111-01）、博邁德 Taq DNA polymerase（貨號：PC0101）和康為世紀Taq DNA polymerase（貨號：CW0680），編號為T1、T2、T3、T4和T5（編號順序與上述提到的公司順序無對應關系）。除酶適應性實驗中用到5種酶外，其余均使用酶T1。PCR反應體系為20 μL：模板2.0 μL（模板用量實驗中分別 用0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μL），10×Taq buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，加ddH2O補足到20 μL。PCR反應程序為：95℃ 3 min；95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30個 循 環(huán)；72℃ 8 min。PCR反應完成后，向PCR產物中加入4 μL 6×loading buffer，混勻，取10 μL進行瓊脂糖電泳檢測，Marker為全式金trans2K Plus DNA Marker。

2 結果

2.1 不同方法制備的DNA模板PCR擴增效率比較

用4種方法制備的模板DNA進行PCR擴增，結果如圖1所示。用1×TE緩沖液沸水?。ǚ椒á颍┲苽涞哪０錎NA和50 mmol/L NaOH溶液沸水浴后再加1/10體積1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液（方法Ⅳ）制備的模板DNA與陽性對照（CK+）擴增結果一致，2對通用引物及5對特異引物都能得到清晰的電泳條帶，而100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）沸水浴（方法Ⅲ）制備的模板DNA只有通用引物擴增得到了清晰的條帶，特異引物擴增只得到微弱的條帶，無菌水沸水浴（方法Ⅰ）制備的模板DNA只有18S rDNA通用引物得到微弱條帶，其余引物均沒有條帶。所以，方法Ⅱ和Ⅳ所制備的模板DNA，用T1酶進行擴增，能得到理想的結果。

表1 PCR引物

圖1 不同方法制備的尖孢鐮刀菌DNA模板PCR擴增結果

2.2 DNA模板對Taq DNA聚合酶的適應性

用實驗室常用的5個不同公司的Taq DNA聚合酶，以方法Ⅱ和Ⅳ所制備的DNA為模板進行PCR，結果如圖2所示。方法Ⅳ得到的模板DNA用5個公司的酶擴增都能得到清晰條帶，但條帶亮度有所不同，而以方法Ⅱ得到的模板DNA，只有用T1酶才能擴增出條帶。所以，方法Ⅱ所得到的模板DNA可以用來進行PCR檢測，但需要選擇活性較高的酶，做檢測前需要進行預備實驗，檢驗所用酶是否能用于該方法制備的模板DNA；而方法Ⅳ得到的模板DNA對酶的適應性較好，5種酶都可用，比方法Ⅱ更具優(yōu)勢。

圖2 不同方法制備的尖孢鐮刀菌模板DNA用不同Taq DNA聚合酶的PCR擴增結果

2.3 不同模板用量對PCR結果的影響

由于使用沸水浴制備的模板DNA都是微量的，無法準確測得其濃度，故而使用不同模板DNA溶液體積進行實驗。用方法Ⅳ制備的模板DNA 0.2-8.0 μL進行PCR反應，結果（圖3）顯示，模板用量為2 μL時，條帶最清晰，模板量高于或低于2 μL條帶亮度減弱。這是由于該方法制備的模板DNA中含有其他雜質（如NaOH、Tris-HCl等），當加入的模板量高時會抑制Taq酶的活性，模板量低，DNA量少，條帶也較弱。因此，使用方法Ⅳ制備的模板DNA時，用量控制在1-4 μL為佳。

圖3 方法IV制備的尖孢鐮刀菌不同模板DNA用量PCR擴增結果

2.4 不同大小片段的PCR擴增

以方法Ⅳ制備的DNA為模板，重新選用5對擴增片段大小不同的引物，進行PCR擴增，結果（圖4）顯示，擴增大小從396-1978 bp均得到單一清晰條帶，片段范圍已能滿足真菌檢測的需要。

圖4 方法IV制備的尖孢鐮刀菌模板DNA不同大小DNA片段的PCR擴增結果

2.5 方法Ⅳ在其他絲狀真菌菌株鑒定中的應用

選用本實驗室保存的絲狀真菌菌株18個，挑取菌絲用方法Ⅳ制備模板DNA，擴增其18S rDNA和 ITS片段，結果如圖5所示。18個菌株與陽性對照一樣都能得到清晰單一的條帶，說明方法Ⅳ除可以制備尖孢鐮刀菌模板DNA外，對其他絲狀真菌也可以制備適合PCR的模板。

圖5 其他絲狀真菌菌株18S rDNA及ITS擴增結果

3 討論

本研究結果表明，方法Ⅳ可以制備優(yōu)質的PCR模板DNA。實際應用中可以根據需要減少或加大NaOH溶液體積，再用1/10體積的1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中和即可，根據體積變化適當增加或減少菌絲量。

用NaOH溶液直接處理粗樣品的方法在水稻、小麥和海洋浮游生物等研究中都有應用，如汪秀峰等［16］用250 mmol/L的NaOH溶液處理水稻葉片，處理過后用HCl和Tris-HCl中和，而后取出處理過的水稻葉片作為PCR模板，但該法每次PCR得用1小塊葉片，加大了樣品的使用量，同時也給PCR增加了額外的步驟；劉鵬等［13］用100 mmol/L的NaOH溶液處理小麥幼葉，但還需經酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，比傳統方法只是省去了液氮速凍和樣品研磨，還不夠簡化；劉泳等［14］用125 mmol/L的NaOH處理海洋浮游生物，25℃處理8 h以上，然后99℃加熱10 min，再加入HCl、Tris-HCl和TritonX-100混合，再次99℃加熱10 min，此法雖簡化了步驟，但是耗時過長。以上的方法與本研究建立的方法相似，但都不夠簡化，這可能與樣品的復雜性相關，有些步驟不可或缺，否則無法達到PCR模板的要求。對于絲狀真菌，陳吉良等［12］建立了一種用10%（W/V）的無菌 Chelex-100 樹脂溶液經沸水浴制備PCR模板DNA的方法，但樣品在處理前需要液氮適當研磨。此法步驟簡單，但需要特殊試劑，成本相對較高；潘力等［15］也建立了一種微波處理置于 10 × TE 緩沖液中的菌絲獲得DNA的方法，但未對該方法獲得的模板DNA進行Taq DNA聚合酶適應性的研究，而本研究發(fā)現TE處理（方法Ⅱ）的樣品具有Taq酶選擇性，只適用于少數Taq DNA聚合酶。

相對于上述方法，本研究建立的方法具有以下優(yōu)點：（1）直接從菌落挑取菌絲，不需要液體培養(yǎng)，不需要磨樣，減化了實驗步驟，大大減少了實驗時間，同時也減少了被污染的幾率；（2）不需使用液氮，只需普通的NaOH和Tris-HCl試劑，且用量少，儀器需要普通離心機、水浴鍋或者電磁爐即可，成本低廉；（3）實驗人員可避免接觸酚、氯仿等毒性有機試劑，安全可靠。

4 結論

本研究以尖孢鐮刀菌為材料，通過對4種方法的比較篩選，建立了一種快速制備絲狀真菌PCR模板DNA的方法。該方法制備模板DNA，無需液氮和研磨，只需少量50 mmol/L NaOH溶液及1 mol/L Tris-HCl，沸水浴10 min及離心10 min即可，可采用實驗室常用的各種Taq DNA聚合酶擴增出18S rDNA和ITS片段及400 bp-2 000 bp大小范圍的特異片段。另外，本法也適用于其他絲狀真菌，可為實驗室大量絲狀真菌的轉化子及菌株的鑒定提供經濟、 簡單、 快速、 安全和高效的方法。。

［1］ Dieffenbach CW， Dveksler GS. PCR p rimer：a laboratory manual［M］. Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2003.

［2］ 鐘肖芬， 鄧日強. Bt 毒素蛋白基因的 PCR 鑒定及定位［J］. 微生物學報， 2001， 41（3）：293-297.

［3］ Brown KA， Brown TA. Biomolecular archaeology［J］. Annu Rev Anthropol， 2013， 42：159-174.

［4］ Gausterer C， Stein C， Stimpfl T. Application of direct PCR in a forensic case of yew poisoning［J］. Int J Legal Med， 2012， 126（2）：315-319.

［5］ 曹鳳明， 沈德龍， 李俊， 等. 應用多重 PCR 鑒定微生物肥料常用芽孢桿菌［J］. 微生物學報， 2008， 48（5）：651-656.

［6］ 戚華雄， 楊蜀蘭. 用聚合酶鏈式反應技術鑒定雜交稻種子純度的初步研究［J］. 湖北農業(yè)科學， 1999（1）：12-14.

［7］ 楊冬燕， 楊小柯， 楊永存， 等. 潲水油聚合酶鏈式反應鑒定技術研究［J］. 中國食品衛(wèi)生雜志， 2011， 23（3）：255-260.

［8］ Edwards K， Johnstone C， Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis［J］. Nucleic Acids Res， 1991， 19（6）：1349.

［9］ Stewart Jr CN， Via LE. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications［J］. Biotechniques， 1993， 14（5）：748-750.

［10］ Griffin D， Kellogg C， Peak K， et al. A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi［J］. Lett Appl Microbiol， 2002， 34（3）：210-214.

［11］ Tendulkar SR， Gupta A， Chattoo BB. A simple protocol for isolation of fungal DNA［J］. Biotechnol Lett， 2003， 25（22）：1941-1944.

［12］ 陳吉良， 黃小龍， 吳安迪， 等. 一種快速高效提取病原真菌DNA作為PCR模板的方法［J］. 菌物學報， 2011， 30（1）：147-149.

［13］ 劉鵬， 邱曉東， 郭智慧， 等. 小麥幼葉 DNA 快速提取新方法及SSR-PCR 擴增［J］. 江蘇農業(yè)科學， 2011（4）：36-37.

［14］ 劉泳， 楊官品. 堿煮法：一種制備海洋浮游生物 PCR 模板DNA 的實用方法［J］. 實驗與技術， 2004， 28（7）：1-4.

［15］ 潘力， 崔翠， 王斌. 一種用于 PCR 擴增的絲狀真菌 DNA 快速提取方法［J］. 微生物學通報， 2010， 37（3）：450-453.

［16］ 汪秀峰， 楊劍波， 向太和， 等. 一種葉片直接用作 PCR 擴增的新方法及其應用［J］. 中國水稻科學， 2002， 16（1）：67-70.

［17］ Borman AM， Fraser M， Linton CJ， et al. An improved protocol for the preparation of total genomic DNA from isolates of yeast and mould using Whatman FTA filter papers［J］. Mycopathologia，2010， 169（6）：445-449.

［18］ Johanson HC， Hyland V， Wicking C， et al. DNA elution from buccal cells stored on Whatman FTA Classic Cards using a modified methanol fixation method［J］. Biotechniques， 2009， 46（4）：309-311.

［19］ Baldini A， Ross M， Nizetic D， et al. Chromosomal assignment of human YAC clones by fluorescence in situ hybridization：Use of single-yeast-colony PCR and multiple labeling［J］. Genomics，1992， 14（1）：181-184.

［20］ Ward AC. Rapid analysis of yeast transformants using colony-PCR［J］. Biotechniques， 1992， 13（3）：350.

（責任編輯 狄艷紅）

A Rapid M ethod of Preparing DNA Tem p late of Filamentous Fungi for PCR Am p lification

Luo Zhongqin1Cheng Lin2Zhang Xi3Chen Guohua1
（1. Institude of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081；2. College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen041004；3. College of Life Science，Beijing Normal University，Beijing100875）

This work aims to establish a novel method of extracting DNA template of filamentous fungi for PCR amplification with boilingwater bath and Fusarium oxysporum as raw material. The procedures of this method are as the following：exposing the fungal mycelia in certain volume of 50 mmol/L NaOH solution under boiling water bath， adding 1/10 volume of 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）buffer， centrifuging it at 12 000 r/min for 10 min， and using the supernatant as the DNA template for PCR amplification. Results demonstrated that the efficiency of PCR amplification with the DNA template prepared by the method was high， the amplified bands were clear， and adaptability to various Taq DNA polymerases was strong；This indicated that the method was suitable for the preparation of DNA template of filamentous fungi. Conclusively， this method is economic， simple， rapid， safe and high-efficient， and can be utilized for high-throughput screening of filamentous fungal transformants and rapid identification of isolated strains.

filamentous fungi；Fusarium oxysporum；PCR amplification；Taq DNA polymerase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.010

2015-01-09

國家自然科學基金項目（31301618）

羅中欽，男，博士，研究方向：蔬菜病原微生物致病機理；E-mail：lzhqin@163.com

陳國華，女，博士，研究方向：蔬菜抗病育種；E-mail：chenguohua01@caas.cn