大孔樹脂純化銀杏葉中總黃酮的工藝研究

陳修文曾 崢唐文文陳小明

（1.湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199；

2.湖南科技學(xué)院 湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用 湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州 425199；3.桂林醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001）

大孔樹脂純化銀杏葉中總黃酮的工藝研究

陳修文1,2曾 崢3唐文文1陳小明1,2

（1.湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199；

2.湖南科技學(xué)院 湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用 湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州 425199；3.桂林醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001）

目的 研究不同型號(hào)大孔樹脂純化銀杏葉總黃酮的工藝條件及參數(shù)。方法 以靜態(tài)飽和吸附量、洗脫量、靜態(tài)洗脫率考察指標(biāo)，比較了5種大孔樹脂，以總黃酮的含量為指標(biāo)對(duì)樹脂吸附工藝條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果 所比較的8種大孔吸附樹脂中，D101樹脂具有最佳的吸附及洗脫參數(shù)，在上樣液濃度為4.0 mg·mL-1條件下，上樣體積為35mL，用70% 的乙醇作為洗脫劑，洗脫流速為3 mL·min-1，得到總黃酮含量為56.89%。結(jié)論 D101樹脂綜合性能較好，可有效地用于銀杏葉黃酮的分離富集。

大孔樹脂；銀杏葉；總黃酮；純化

近年來(lái)，銀杏葉的研究開發(fā)成為國(guó)內(nèi)外的矚目熱點(diǎn)，它不僅是一種天然藥物，其藥品及有關(guān)產(chǎn)品在國(guó)際上十分走俏，而且還是一種優(yōu)良的功能性食品添加劑[1]。銀杏葉中主要有效成分為黃酮類和萜內(nèi)酯類，其中銀杏黃酮具有擴(kuò)張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、調(diào)血脂等作用，可用于治療心腦血管疾病、腎病綜合征、糖尿病、血管性癡呆等[2-4]。中國(guó)擁有銀杏資源優(yōu)勢(shì)，開發(fā)潛力很大[5]，而永州作為一個(gè)銀杏種植基地，一直并未開發(fā)。本文針對(duì)永州本地銀杏葉，采用靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，篩選最佳大孔樹脂，對(duì)大孔樹脂分離純化銀杏葉黃酮的主要影響因素進(jìn)行考察，優(yōu)化樹脂分離工藝參數(shù)，為開發(fā)利用銀杏葉黃酮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器、材料和試劑

1.1儀器

實(shí)驗(yàn)儀器：KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；UV –2800型紫外可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；HH -4S型水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮生儀器廠)；SHB-循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；粉碎機(jī)(江陰市偉翔藥化機(jī)械廠)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2材料與試劑

銀杏葉，采集于湖南永州市東安縣，曬干后貯藏。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、三氯化鋁、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸均為分析純；大孔吸附樹脂AB-8型、LKY-02型、HPD750型、MD130型、D101型、HPD450型、HPD5000型、MD131型（均為南開大學(xué)化工廠）。

2　方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測(cè)定

2.1.1取粉碎的銀杏葉藥材適量，加10倍(生藥量) 的65% 乙醇回流提取2次，每次3 h，過濾，合并濾液，減壓回收至干，備用。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取6.2mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解并定容至25mL，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為0.24mg·mL-1。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液(0.24 mg·mL-1) 0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.50mL至10mL量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6min；再加10%硝酸鋁溶液0.30mL，搖勻，靜置6min，再加4%氫氧化鈉溶液4.00mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。以70%乙醇為空白，在510nm處測(cè)吸收度。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為濃度C和吸收度A的關(guān)系：y=0.652x + 0.001，r=0.998。

2.1.3樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.50g提取物，用70%乙醇溶解并定容至25mL；精確量取1.0mL，用70%乙醇定容至100mL量瓶中。精確量取5mL，按照制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮濃度。

2.2不同型號(hào)吸附樹脂篩選研究

2.2.1樹脂的預(yù)處理[6]將大孔樹脂于95%乙醇中浸泡8h，然后用蒸餾水洗至無(wú)乙醇味；再用5%HCl溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至流出水pH值為中性；然后用5%NaOH溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至流出水pH值為中性。每次上樣洗脫完畢后，先用2%HCl洗至無(wú)色及用蒸餾水洗至pH值為中性；再用2%NaOH洗至無(wú)色,最后用蒸餾水洗至pH值為中性。

2.2.2大孔樹脂靜態(tài)吸附量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取已處理好的8種不同型號(hào)大孔樹脂(用濾紙吸干)1g，置于三角瓶中，加入配制好的濃度為4.0 mg·mL-1的銀杏葉黃酮提取液100mL，置于搖床中(25℃，50r/min)靜態(tài)吸附24h，測(cè)其溶液的吸光度，代入回歸方程計(jì)算相應(yīng)的黃酮濃度。按下式計(jì)算每一種樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)飽和吸附量，吸附率及解吸率，結(jié)果見表1。

式中：Q 為靜態(tài)吸附量( mg /g)；C0為初始濃度(mg·mL-1)；Cv為剩余濃度(mg·mL-1)；V 為溶液體積(mL)；W 為樹脂質(zhì)量( g )。

假設(shè)吸附前后溶液體積不變, 按下式計(jì)算吸附率：

取上述吸附飽和的大孔吸附樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無(wú)色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，置于三角瓶中，加入80mL 90% 乙醇溶液置于搖床中(25℃，50r /min) 進(jìn)行靜態(tài)解吸24h，將樹脂濾出，測(cè)定濾液中總黃酮濃度，并按下式計(jì)算解吸率：

C為解吸液濃度(mg /mL)；V為解吸液體積(mL)；Q為靜態(tài)吸附量( mg /g)；M為樹脂質(zhì)量(g)。

表1. 八種大孔樹脂對(duì)銀杏黃酮的吸附率及解吸率

結(jié)果表明：各樹脂的靜態(tài)飽和吸附量相差較大，其中D101樹脂的飽和吸附量及解吸率均明顯優(yōu)于其他各型號(hào)樹脂，綜合考慮吸附和解吸兩方面的因素，可以認(rèn)為D101樹脂對(duì)銀杏葉總黃酮具有較好的吸附解吸能力，因此初步確定選用D101樹脂純化銀杏葉總黃酮。

2.3動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.3.1最大吸附量考察 濃度為4.0mg/mL的銀杏葉黃酮提取液100mL通過D101大孔樹脂的吸附柱，D101大孔樹脂裝柱(φ l.5cmx30cm)，徑高比為1:8，上樣量是100mL上述儲(chǔ)備樣品液，控制上樣流速為2.04mL/min，每次收集5mL過柱液為一管，逐管取ImL檢測(cè)其黃酮含量。

從圖1也可以看到，泄露曲線呈現(xiàn)出一個(gè)濃度梯度，本實(shí)驗(yàn)在裝柱徑高比為1:8時(shí)，找到最佳泄露點(diǎn)（泄漏點(diǎn)是指該處泄漏液黃酮的濃度值為上柱前樣液黃酮濃度值的1/10），宜量取35mL上樣液。

圖1. D101大孔樹脂吸附銀杏葉總黃酮的泄露曲線

2.3.2 洗脫劑濃度對(duì)銀杏葉總黃酮轉(zhuǎn)移率及含量影響 取35mL(總黃酮濃度4.0mg/mL)銀杏葉樣品液，上柱后用分別用30%、50%、70%、95%的乙醇洗脫。收集洗脫液,將乙醇洗脫液回收乙醇，分別濃縮，真空干燥、稱重。測(cè)定總黃酮轉(zhuǎn)移率和含量，結(jié)果見表2。由表可知乙醇濃度95%時(shí)轉(zhuǎn)移率較高，但是由于乙醇濃度高，將大部分雜質(zhì)洗脫下來(lái)，含量很低。30%乙醇洗脫時(shí)，轉(zhuǎn)移率和含量都較差。相對(duì)于50%乙醇濃度，70%乙醇洗脫黃酮含量高，因此洗脫劑選擇乙醇濃度為70%。

表2.不同濃度乙醇洗脫部分總黃酮轉(zhuǎn)移率及含量

2.3.3洗脫液流速對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率影響 準(zhǔn)確處理好的D101樹脂4份，分別上柱(柱子的徑高比為1：8)，準(zhǔn)確吸取50mL(總黃酮濃度4.0 mg·mL-1)銀杏葉樣品液，以流速1mL/min上柱，吸附完全后，洗脫時(shí)分別以1、2、3、4 mL·min-1進(jìn)行洗脫。70%乙醇洗脫液濃縮干燥,測(cè)定總黃酮濃度，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。

表3. 流速對(duì)D101樹脂轉(zhuǎn)移率的影響

由表可知洗脫流速為3 mL·min-1時(shí)轉(zhuǎn)移率相對(duì)較大，洗脫流速為2 mL·min-1轉(zhuǎn)移率也較大，但是速度慢，綜合考慮選擇mL·min-1作為洗脫液流速。

2.4銀杏葉總黃酮純度測(cè)定結(jié)果

在銀杏葉黃酮提取原液中，黃酮純度為8.51%，經(jīng)D101樹脂在最佳工藝條件下精制后總黃酮純度為56.89%。說明大孔吸附樹脂技術(shù)可以用于銀杏葉黃酮的分離純化工藝中。

3　討　論

在所選擇的8種大孔樹脂中，根據(jù)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，我們初步確定D101型大孔樹脂屬于快速吸附樹脂，吸附量和解吸率都較高，是理想的適用于銀杏葉黃酮吸附分離的樹脂類型。根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果表明：裝填己經(jīng)預(yù)處理D101樹脂的徑高比為1:8，上樣液濃度為4.0 mg·mL-1，上樣體積為35mL，用70% 的乙醇作為洗脫劑，洗脫流速為mL·min-1，得到總黃酮含量為56.89%。

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（責(zé)任編校：何俊華）

Q94

A

1673-2219（2015）05-0058-03

2014－12－21

湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(項(xiàng)目編號(hào)：XNZW14C04); 湖南科技學(xué)院校級(jí)課題資助(項(xiàng)目編號(hào)14XKY108)。

陳修文（1987－），男，湖南永州人，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬镅芯俊?/p>