HPLC測定馬甲子藥材中馬甲子1#的含量

宋聯(lián)強(qiáng) ， 武蕊娟 ， 譚 鐳 ， 詹 雁 ， 阮 佳 ， 徐超群

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

0 引 言

馬甲子 Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.系鼠李科銅錢屬植物，又名鐵籬笆、銅錢樹。其根部具有發(fā)表解熱，祛風(fēng)利濕，治跌打損傷及心腹疼痛的功能，其葉具有治癰瘡潰瘍作用[1]。經(jīng)本課題組的前期研究證實(shí)其葉也具有抗腫瘤作用且療效較好。為了探索馬甲子葉中的相關(guān)活性成分，本文對馬甲子葉中的某些成分進(jìn)行了提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤等方面的研究，得到了新的活性單體馬甲子1#，為了進(jìn)一步研究該成分，制定了本文的含量測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

1200高效液相色譜儀（美國安捷倫）；Sartorius BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；水（樂百氏純凈水）；甲酸、甲醇 (分析純,成都市科龍化工試劑廠）。

藥材：于2013年6月采自四川省牧馬山的鮮葉，經(jīng)鑒定為鼠李科銅錢屬植物馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.，冷凍干燥備用；馬甲子1#對照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：14070109），純度經(jīng)歸一化法測定為97.4%。馬甲子1#經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，屬于新化合物，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 馬甲子1#結(jié)構(gòu)式

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為BDS HYPERSIL C18色譜柱（4.6mm×100mm×2.4μm，Thermo Fisher Scientific）；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為320 nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為10μL。理論塔板數(shù)按馬甲子1#計(jì)算應(yīng)不低于3000。分別選擇乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，考察不同流動相系統(tǒng)對樣品的分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)時(shí)主峰與雜質(zhì)峰分離較好，且分離度＞1.5，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)。在小范圍內(nèi)改變進(jìn)樣體積、柱溫及流速，色譜圖無明顯變化。對照品和供試品溶液的色譜圖分別見圖2（a）和圖 2（b）。

1.2.2 樣品的制備

精密稱取馬甲子1#對照品適量，用甲醇制成含馬甲子1#0.1068mg/mL的對照品貯備液。分析測試中所用對照品溶液由對照品貯備液稀釋得到。

取馬甲子藥材粉末（過4號篩）約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50mL，稱定質(zhì)量，回流提取2h后，取出，冷卻，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

1.2.3 線性范圍考察

分別精密移取馬甲子1#對照品貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，8.0mL 置于 10mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定馬甲子1#的峰面積，并以進(jìn)樣量對其峰面積進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y馬甲子1#=2.396×103X-4.758（r=0.9999）。結(jié)果表明馬甲子1#在0.021 4～0.854 4 μg范圍進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖3。

圖2 對照品和供試品溶液的色譜圖（HPLC）

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.2.4 精密度試驗(yàn)

取含馬甲子1#0.021 36 mg/mL的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算馬甲子1#峰面積的RSD為0.73%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號的馬甲子藥材粉末（過4號篩）6份，按“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測定，計(jì)算馬甲子1#含量的RSD為0.70%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

圖3 馬甲子1#標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一對照品溶液，于室溫下 0，2，4，6，8，12，24h分別進(jìn)行測定，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算馬甲子1#的RSD為1.05%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已測定含量的馬甲子藥材粉末（過4號篩）約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共6份，分別精密加入對照品貯備液5mL，精密加入95%乙醇50mL，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定，結(jié)果表明回收率較好（見表2）。

1.2.8 樣品測定

在本文色譜條件下，被測成分與其他化合物色譜峰分離度均良好。對10批馬甲子藥材進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

2 討 論

馬甲子藥材中馬甲子1#含量的測定試驗(yàn)，通過前期單因素試驗(yàn)考察了馬甲子1#的提取工藝，并從操作便捷性和節(jié)約資源等方面綜合考慮最終確定了供試品溶液的制備方法。用本文色譜條件測定10批馬甲子藥材中馬甲子1#的含量，其中批號140523的藥材中馬甲子1#含量最高，同時(shí)該批次馬甲子藥材抗腫瘤活性最強(qiáng)，由此進(jìn)一步確定其為馬甲子藥材抗腫瘤活性成分之一。馬甲子1#含量的測定能夠初步評價(jià)不同產(chǎn)地、不同采收期馬甲子藥材的質(zhì)量，為民間癌癥患者用藥提供了一定的參考。

表2 加樣回收率測定結(jié)果

表3 10批藥材中馬甲子1#含量

3 結(jié)束語

目前對馬甲子的研究主要集中在其根、莖、果實(shí)中化學(xué)成分的分離鑒定[2-4]，而馬甲子葉中化學(xué)成分的研究未見報(bào)道。馬甲子1#屬于從馬甲子葉中分離得到具有白樺酸母核的新的五環(huán)三萜類化合物[5-10]，具有一定的抗腫瘤活性，有較好的研究前景。本文所建立的HPLC法能有效地將馬甲子藥材中馬甲子1#與其他成分分開，分離度＞1.5，且峰形較好，分析時(shí)間短，為馬甲子1#定量分析提供了參考，為后期的深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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