蝴堞蘭病毒病檢測(cè)與防治

張清

蝴蝶蘭從20世紀(jì)80年代之前的珍貴高價(jià)蘭花蛻變?yōu)楝F(xiàn)今的平價(jià)消費(fèi)性盆花，但臺(tái)灣業(yè)者在20世紀(jì)80～90年代由于國(guó)際市場(chǎng)需求量遠(yuǎn)高于臺(tái)灣本土產(chǎn)能，在買方市場(chǎng)的大環(huán)境刺激下，的確有部分業(yè)者忽略蘭花病毒病管控之重要性。因此當(dāng)荷蘭加入蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)后，國(guó)際上經(jīng)常有對(duì)臺(tái)灣蝴蝶蘭種苗病毒感染比例過高的疑慮，而對(duì)臺(tái)灣蝴蝶蘭的外銷造成部分沖擊。目前多數(shù)臺(tái)灣業(yè)者均已引進(jìn)病毒病控管機(jī)制，否則勢(shì)將遭到淘汰。特別是那些過去幾年提早實(shí)施病毒病控管的業(yè)者，在最近國(guó)際經(jīng)濟(jì)危機(jī)下仍然保有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，更凸顯病毒病控管的重要性。本文將針對(duì)近幾年來臺(tái)灣產(chǎn)官學(xué)界在蝴蝶蘭病毒檢測(cè)與防治上的成果與最新進(jìn)展加以說明，希望使蘭花界朋友能有更清楚的認(rèn)識(shí)與了解。

一、蘭花病毒的發(fā)現(xiàn)與鑒定

臺(tái)灣學(xué)術(shù)界早于1973年及1980年即已分別證實(shí)臺(tái)灣蘭花上有蕙蘭嵌紋病毒（CymMV）及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV） 的存在。1988年又發(fā)現(xiàn)胡瓜嵌紋病毒（CMV） 可以感染蘭花。因此當(dāng)1990年臺(tái)灣蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)開始萌芽時(shí)，政府部門的蘭花病毒防治策略即已針對(duì)三種病毒進(jìn)行擬定。不過在1990年至2003年間有一種有別于上述三種病毒病征的黃化輪斑癥狀（vellow ringspotsyndrome）一直出現(xiàn)在臺(tái)灣各蘭園，尤其是白花品系的品種發(fā)生比較普遍。當(dāng)時(shí)幾個(gè)進(jìn)行蘭花病毒研究的實(shí)驗(yàn)室，包括臺(tái)灣研究所與筆者甚至國(guó)外包括荷蘭在內(nèi)的病毒學(xué)者都一直無法證實(shí)此一癥狀是否為病毒感染所致。由于此種黃化輪斑病癥經(jīng)常出現(xiàn)在臺(tái)灣外銷到各國(guó)的種苗上，雖不確定是哪種病毒所感染，國(guó)際上仍然將其通稱為“臺(tái)灣病毒Taiwanvirus”，因而對(duì)臺(tái)灣蝴蝶蘭外銷形象有所影響。所幸到了2003年臺(tái)灣農(nóng)改場(chǎng)陳慶忠博士與中興大學(xué)詹富智教授合作，終于證實(shí)此病癥乃由一種當(dāng)時(shí)國(guó)際上剛剛發(fā)現(xiàn)鑒定的新病毒所引起。此病毒乃由澳洲學(xué)者于番椒上所發(fā)現(xiàn)，并且命名為番椒黃化病毒 （Capsicumchlorosisvirus），簡(jiǎn)稱CaCV。由于澳洲學(xué)者首先發(fā)表與命名，因此遵照國(guó)際慣例將此一造成蘭花產(chǎn)生黃化輪斑之病毒定名為CaCV。不過荷蘭在2008年也正式宣稱，在其國(guó)內(nèi)蝴蝶蘭上亦發(fā)現(xiàn)另二種病毒可以造成與臺(tái)灣病毒（CaCV）相同的病征，其一為鳳仙花壞疽斑點(diǎn)病毒（Impetiens necroticspotvirus，INSV），其二為蕃茄斑點(diǎn)萎凋病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）。荷蘭并且承認(rèn)所謂的臺(tái)灣病毒的稱謂并不適當(dāng)。

2008年中興大學(xué)詹富智教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在蝴蝶蘭上首次發(fā)現(xiàn)一種馬鈴薯Y屬病毒感染的病例，該病毒會(huì)造成葉片產(chǎn)生黃化斑點(diǎn)病癥，因此他們將其暫時(shí)命名為Phalaenopsischloroticspotvirus（PhCSV）。不過此一病毒與同時(shí)期臺(tái)灣大學(xué)張雅君教授實(shí)驗(yàn)室于俗稱皇宮菜的洛葵（basella）上所發(fā)現(xiàn)的另一種馬鈴薯Y屬病毒（Basellarugosemosaicvirus，BaRMV） 分子特性完全相同。故而二者理論上應(yīng)該視為同一種病毒而給予同一種命名。由于BaRMV在臺(tái)灣皇宮菜上發(fā)生極為普遍，而蝴蝶蘭的PhCSV僅偶然出現(xiàn)在特定地區(qū)。因此判斷蝴蝶蘭上的PhCSV可能是皇宮菜上的BaRMV經(jīng)由蚜蟲傳播所致。若以此角度來看，此一病毒稱為BaRMV可能較符合實(shí)際發(fā)生的狀況。

截至目前，經(jīng)過筆者最新確認(rèn)的全球各地報(bào)導(dǎo)可以感染蘭花的病毒種類已經(jīng)高達(dá)57種，其中有41種為分類地位明確的病毒，另外16種則屬特性有待理清，分類地位仍不明的種類。對(duì)于蝴蝶蘭而言，目前我們掌握的全球資料中，可能的病毒種類有12種，其中有8種特性清楚分類確定，其余4種則仍有待鑒定。此8種可以感染蝴蝶蘭的病毒種類中，真正確認(rèn)發(fā)生于臺(tái)灣的只有ORSV，CymMv，CaCV，CMV及PhCSV等5種。這五種病毒中經(jīng)過調(diào)查以O(shè)RSVGNCymMV分布較為普遍，重要性較高。其次則為CaCV。其他二種事實(shí)上因?yàn)樾杞?jīng)由蚜蟲傳播，而蝴蝶蘭多栽培于溫室內(nèi)，蚜蟲發(fā)生可能性低，故發(fā)生的案例極少，重要性并不高。不過所有可能發(fā)生的8種蝴蝶蘭病毒臺(tái)灣方面均已完全掌握檢測(cè)的技術(shù)，并且官方多年來一直委由筆者及其他實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期持續(xù)監(jiān)測(cè)此等病毒之發(fā)生，確保除5種已存在的病毒外不再有入侵之機(jī)會(huì)。

二、蘭花病毒檢測(cè)技術(shù)之開發(fā)

臺(tái)灣早在20世紀(jì)90年代初期筆者研究室即已建立CymMV、ORSV及CMV等蘭花病毒之抗血清制作與ELISA檢定技術(shù)，在當(dāng)時(shí)技術(shù)水平實(shí)際上已經(jīng)與國(guó)際同步。2003年當(dāng)CaCV被確認(rèn)為引起蝴蝶蘭黃化輪斑的病毒后，因?yàn)楣P者研究室早已在大巖桐盆花上研究過相同的病毒（HT-1），且已建立檢測(cè)技術(shù)，因此當(dāng)時(shí)即順利以HT-1的抗血清開始全面應(yīng)用于CaCV之檢測(cè)服務(wù)。

1995年筆者首度發(fā)展出蘭花病毒ORSV與Cym-MV之RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，將臺(tái)灣蘭花病毒帶入核酸檢定之層次。到了1999年我們已經(jīng)成功開發(fā)出可以于單步驟下同時(shí)檢定ORSV及CymMV之RT-PCR技術(shù)，也就是所謂的單步聚多目標(biāo)型（SinglestepmultiplexRT-PCR）。此技術(shù)比傳統(tǒng)只能偵測(cè)單一病毒之RT-PCR技術(shù)節(jié)省一倍時(shí)間、人力及材料成本。此一技術(shù)已分別于2006及2007年授權(quán)新高及臺(tái)霖二家蘭花種苗公司使用。2008年我們更進(jìn)一步發(fā)展出可同時(shí)檢測(cè)ORSV與CymMV二種病毒之多目標(biāo)型免疫捕捉RT-PCR技術(shù)（Multipleximmune-captureRT-PCR），此技術(shù)運(yùn)用此二病毒之抗體進(jìn)行RNA的專一捕捉，可以免除蘭花樣品檢測(cè)前繁瑣的RNA純化步驟，提升檢測(cè)效率，適合大量樣品之作業(yè)。

2006年筆者針對(duì)RT-PCR技術(shù)在結(jié)果判斷上的弱點(diǎn)加以改進(jìn)，發(fā)展出所謂的生物品片檢測(cè)系統(tǒng)，此系統(tǒng)可以同時(shí)檢測(cè)ORSV及CymMV二種病毒。2008年筆者進(jìn)一步開發(fā)出可同時(shí)檢測(cè)ORSV、CymMV及CaDV等三種病毒之單步驟多目標(biāo)型RT-PCR技術(shù)及生物晶片檢測(cè)系統(tǒng)。此等生物晶片檢測(cè)系統(tǒng)均已技轉(zhuǎn)晶宇生技公司，進(jìn)行商業(yè)量產(chǎn)及推廣，目前約有十家臺(tái)灣蘭花廠商引進(jìn)此一系統(tǒng)，建立自我檢測(cè)品管實(shí)驗(yàn)室。

2008年初筆者離開農(nóng)業(yè)試驗(yàn)所，轉(zhuǎn)往朝陽(yáng)科技大學(xué)任教，2009年我們甚至已經(jīng)開發(fā)出可以同時(shí)檢測(cè)ORSV及CymMV等五種蘭花病毒的生物晶片系統(tǒng)。2010年研究室更進(jìn)一步建立了目前極受國(guó)際科學(xué)界矚目的新技術(shù)——即時(shí)定量RT-PCR，此一技術(shù)改進(jìn)了先前所有病毒檢測(cè)技術(shù)只能夠進(jìn)行定性判別的限制，可以在2～3小時(shí)內(nèi)完成定量的檢測(cè)，且由于數(shù)據(jù)化的結(jié)果，在重現(xiàn)性與客觀性上都獲得相當(dāng)程度的進(jìn)行。目前荷蘭NAK也開始嘗試運(yùn)用此一技術(shù)進(jìn)行蘭花病毒的偵測(cè)與鑒定。我們本年度更首度發(fā)展出可以同時(shí)檢測(cè)ORSV與CymMV的即時(shí)定量RT-PCR技術(shù)系統(tǒng)，可以節(jié)省一半的檢測(cè)成本費(fèi)用，因此臺(tái)灣在技術(shù)開發(fā)上已經(jīng)稍有領(lǐng)先。

三、病毒檢測(cè)之實(shí)際推廣與應(yīng)用

學(xué)研界所開發(fā)之病毒測(cè)技術(shù)無非是為了能夠提供可行的方法，讓蘭花業(yè)者能夠在種苗生產(chǎn)過程中，明確判斷出感染或未感染的蘭花材料，避免繁殖出感染病毒的種苗。因此這些技術(shù)必須能落實(shí)應(yīng)用于蘭花產(chǎn)業(yè)界，才能真正解決產(chǎn)業(yè)界之需求。因此筆者早在20世紀(jì)90年代省政府農(nóng)林廳期間即開始接受委托辦理“蘭花病毒檢定技術(shù)研究”計(jì)劃，將抗血清檢定技術(shù)無償轉(zhuǎn)移各試驗(yàn)改良場(chǎng)所及部分中大型蘭花種苗業(yè)者，協(xié)助其建立自我病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。

另外筆者研究室同時(shí)也接受業(yè)界蘭花廠商的委托，進(jìn)行無償?shù)臋z測(cè)服務(wù)。我們于2003年起開始辦理蘭花病毒有償檢測(cè)服務(wù)工作，按件計(jì)酬，向委托業(yè)者收取規(guī)費(fèi)（其收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)乃經(jīng)過財(cái)政部之核定，受規(guī)費(fèi)法之限制）。直到筆者2008年初離開農(nóng)試所為止，五年來累計(jì)曾經(jīng)接受59家不同蘭花業(yè)者之檢測(cè)委托，服務(wù)樣品估計(jì)達(dá)6萬個(gè)以上。

2003年至2008年期間我們也曾通過技術(shù)授權(quán)作業(yè)，正式將所開發(fā)之病毒檢測(cè)技術(shù)移轉(zhuǎn)私人企業(yè)，協(xié)助其建立病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，其中包括新高、臺(tái)霖與晶宇生物技術(shù)，目的是希望能使檢測(cè)技術(shù)能廣泛應(yīng)用于蘭花產(chǎn)業(yè)界，加速蘭花病毒植株的淘汰與無病毒種苗之生產(chǎn)。后來晶宇生技甚至將其生物晶片之檢測(cè)平臺(tái)商業(yè)銷售推廣于國(guó)內(nèi)廠商應(yīng)用。目前有臺(tái)糖等10家業(yè)者引進(jìn)此一系統(tǒng)。

事實(shí)上由于臺(tái)灣多數(shù)的蘭花生產(chǎn)者、組培廠商與外銷業(yè)者多屬小型廠商，建立自我檢測(cè)品管實(shí)驗(yàn)室，對(duì)他們來講在成本考量上并不經(jīng)濟(jì)。若完全仰仗公家研究單位或?qū)W校實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)服務(wù)，在效率與服務(wù)品質(zhì)上已尼無法呼應(yīng)廣大業(yè)界之需求。因此，2004～2009年間國(guó)科會(huì)所成立的農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家型計(jì)劃策略決定，將農(nóng)業(yè)分子檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向著重于檢測(cè)服務(wù)型企業(yè)之催生與輔導(dǎo)。此期間曾經(jīng)接受國(guó)科會(huì)計(jì)劃輔導(dǎo)之廠商包括晶宇、睿嘉及宏良甫等，這些廠商后來均成為現(xiàn)今蘭花病毒檢測(cè)服務(wù)與試劑的供應(yīng)廠商，構(gòu)成目前我國(guó)蘭花病毒檢測(cè)服務(wù)之基石。2008年筆者輔導(dǎo)艾瑞克生技公司成為另一家獨(dú)立專責(zé)的檢測(cè)服務(wù)公司，進(jìn)行多種蘭花病毒之免疫與分子檢測(cè)服務(wù)。

由于檢測(cè)服務(wù)企業(yè)化乃國(guó)際間包括荷蘭、美國(guó)與日本等先進(jìn)國(guó)家運(yùn)行現(xiàn)況，企業(yè)化的運(yùn)作可以提高服務(wù)彈性、效果及品質(zhì)，而且讓企業(yè)間自由競(jìng)爭(zhēng)，本來就是相互砥礪成長(zhǎng)的自然法則，依賴公家單位或?qū)W研界進(jìn)行“兼差式”的檢測(cè)服務(wù)，不僅會(huì)磨損本應(yīng)單純專責(zé)于研究工作的技術(shù)人員的精力，其效率與彈性亦不敷競(jìng)爭(zhēng)嚴(yán)苛的產(chǎn)業(yè)界之需求。

目前臺(tái)灣在檢測(cè)服務(wù)的架構(gòu)上乃由“檢測(cè)服務(wù)企業(yè)”、“公家或大學(xué)檢測(cè)服務(wù)”、“蘭花業(yè)者內(nèi)部自我品管”與“試劑套組制造與供應(yīng)企業(yè)”等來源構(gòu)成四大基石。依據(jù)筆者的觀察，四者中目前以私部門所提供之檢測(cè)服務(wù)占有最大的比例。故此等運(yùn)用測(cè)技術(shù)之模式與發(fā)展上，已經(jīng)符合國(guó)際之趨勢(shì)，且應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)的普及率與效率上，已經(jīng)超出任何競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。