秋水仙素在肺癌染色體鑒定方法中的應用研究

彭積貴　何昌進

[摘要] 目的 探索一種肺癌染色體分析的有效方法。 方法 通過原代培養(yǎng)獲取肺癌單細胞，采用G顯帶染色，比較不同秋水仙素作用量和作用時間及不同低滲時間所獲取的染色體數量、形態(tài)及條帶情況。 結果 秋水仙素0.1 μg/ml作用100 min，低滲20 min獲得的染色體數量多、形態(tài)規(guī)則勻稱，條帶清晰。 結論 秋水仙素可用于肺癌核型分析及獲取肺癌染色體譜。

[關鍵詞] 秋水仙素；肺癌；染色體；核型分析；優(yōu)化

[中圖分類號] R446 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）09（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate a effective method on the Colchicine in chromosome identification method in lung cancer. Methods Single cell was obtained from primary culture，the number，morphology and strip situation of lung chromosome with the different dosage and time of colchicine as well as different hypotonic time via uesing G—banding were compared. Results The chromosome with better quantity，regular morphology and clear bands was obtained in the group treated with 0.1 μg/ml Colchicine culturing 100 min and hypotonicing 20 min. Conclusion Colchicine can be used for karyotype analyses，and the chromosome in lung cancer is obtained.

[Key words] Colchicine；Lung；Chromosome；Karyotype analyses；Optimization

肺癌是全球高發(fā)惡性實體瘤之一，其發(fā)病率與死亡率均占惡性腫瘤首位。肺癌等實體瘤中廣泛存在染色體異常，染色體異常導致基因異常擴增、表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后等密切相關[1-3]。實體瘤的染色體不穩(wěn)定性研究可為腫瘤治療提供新的治療靶點，如淋巴瘤、慢性粒細胞白血病等血液病中特異染色體異常，為該病治療提供有效方法[4]，然而，實體瘤與血液腫瘤存在組織差異，導致其染色體分析更為復雜、困難。本文通過優(yōu)化實體瘤染色體分析相關影響因素對肺癌核型分析方法進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、人表皮生長因子（human epidermal growth factor，hEGF）、氫化可的松、青鏈霉素、0.25%胰蛋白酶，均購自美國Gibco公司；膠原酶購自美國Sigma公司；分散酶購自瑞士Roche公司，秋水仙素、Giemsa染料購自北京天恩澤基因科技有限公司。其他試劑均為分析純以上。

1.1.2 組織標本 肺癌標本取自2013年5月～2014年5月福建醫(yī)科大學附屬寧德市醫(yī)院新鮮手術標本，術前未進行放療和化療，術后均經常規(guī)病理證實，并經醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.1 原代培養(yǎng)

取新鮮肺癌手術組織，將組織塊剪碎，加入25 ml消化酶（0.1%Ⅱ型膠原酶、0.15%分散酶），37℃消化至組織塊消失，過濾離心2遍，加入培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h后進行制片。

1.2 染色體制備

1.2.1 秋水仙素用量 取原代肺癌細胞A、B、C、D、E五組，每組分5份，實驗前夜換液，次日分別加入濃度為20 μg/ml的秋水仙素30、40、50、60、70 μl，37℃培養(yǎng)120 min，離心去上清液，分別加入0.075 mol/L氯化鉀溶液，低滲30 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比較秋水仙素不同濃度的作用效果。

1.2.2 秋水仙素作用時間 根據1.2.1所得最佳結果取原代肺癌細胞A、B、C、D、E五組，每組分5份加入秋素，37℃分別培養(yǎng)80、100、120、140、160 min，離心去上清液，分別加入0.075 mol/L氯化鉀溶液，低滲30 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比較秋水仙素不同培養(yǎng)時間的作用效果。

1.2.3 低滲時間 根據1.2.1和1.2.2所得最佳結果取原代肺癌細胞A、B、C、D、E五組，每組分5份加入秋水仙素培養(yǎng)，離心去上清液，分別加入0.075 mol/L氯化鉀溶液，分別低滲10、20、30、40、50 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比較不同低滲時間的作用效果。

1.2.4 固定 低滲后加入現配固定液（醇∶冰醋酸=3∶1）2 ml混勻，預固定5 min，1000 r/min離心10 min，去上清液，加固定液8 ml，重懸混勻后固定10 min，重復2遍，去上清液。

1.2.5 滴片、烤片 每管加入新鮮固定液0.5～1 ml混勻成細胞懸液，取1滴細胞懸液滴至預冷的-20℃載玻片中使細胞均勻散開，放置80℃烤箱烤片5～6 h。

1.2.6 染色 將烤好的載玻片放入37℃胰酶消化27 s，每張加入Giemsa染料2 ml，染色6 min，自來水沖洗去除染料，置濾紙上，室溫干燥。

1.2.7 鏡檢 每張片高倍鏡下隨機選取10個視野，觀察并記錄分裂中期細胞數，油鏡下觀察染色體形態(tài)特征。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以x±s表示，組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 秋水仙素用量

原代肺癌細胞中加入不同濃度秋水仙素，在作用時間和低滲時間不變的情況下，秋水仙素濃度越高，染色體長度越粗短（圖1），但獲得的分裂中期細胞數差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

2.2 秋水仙素作用時間

秋水仙素作用時間越長，染色體長度越粗短（圖3），且獲得的分裂中期細胞數相對增多，但差異無統計學意義（P>0.05）（圖4）。

2.3 低滲時間

低滲時間短，獲得的分裂中期細胞數多，染色體易疊加成團，低滲時間長，獲得的細胞數少，染色體易分散，40 min和50 min組與10、20、30 min組比較差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）；原代肺癌細胞中加入秋水仙素50 μl培養(yǎng)100 min，低滲20 min，獲得的染色分散均勻，長度適中，形態(tài)規(guī)則，條帶清晰，有利于染色體觀察分析（圖6）。

3 討論

細胞核型鑒定臨床上多見于血液腫瘤及先天性遺傳病，明確細胞核型對指導血液腫瘤的治療及評估預后具有重要的指導意義。Grigorova等[5]通過細胞系培養(yǎng)核型分析發(fā)現肺癌等實體瘤中也存在大量的染色體變異，且不同的核型變化對臨床肺癌治療具有一定的指導意義。此外，多項研究表明，肺癌染色體形態(tài)多形性對預后具有指導性意義[6-7]。然而，由于實體瘤組織呈團塊狀，癌灶中細胞周期存在明顯差異，且需將組織塊消化成單細胞，這些特性將影響秋水仙素的作用量和時間及細胞低滲時間等，因此實體瘤核型鑒定需對秋水仙素等影響因素進行優(yōu)化。秋水仙素具有抑制細胞分裂前期紡錘絲的形成，使細胞分裂停留在中期，以積累大量的中期細胞的功能[8-10]。然而秋水仙素對細胞具有一定毒性，分裂中期染色體形態(tài)隨秋水仙素的量及作用時間變化而發(fā)生改變，嚴格掌握秋水仙素作用時間和量是染色體制片成功的關鍵[11-13]。秋水仙素的濃度和培養(yǎng)時間只有精確到最小濃度和最佳時間，才能收集到中期棒狀的染色體，濃度過大產生細胞毒性作用，染色體快速凝縮，使分裂相減少和染色體臂短粗，表面毛糙，邊緣不齊，明暗帶紋顯示不清，影響G顯帶制作效果，若阻斷培養(yǎng)時間超時，中期染色體在秋水仙素的作用下逐漸凝縮，染色體丟失，制片失敗[14-15]。本文采用細胞原代培養(yǎng)法獲取原代肺癌細胞，通過比較不同秋水仙素濃度及作用時間發(fā)現，0.1 μg/ml（50 μl）秋水仙素作用100 min，染色體大小長短適中，形態(tài)規(guī)則，適合G顯帶及觀察。低滲時間是另一個染色體制片的重要影響因素，低滲時間長，細胞膜易破裂獲得細胞數少，且原代肺癌細胞經消化后細胞膜損傷更易發(fā)生破裂，若低滲時間短，細胞膨脹不充分，滴片后包漿不易分散，背影雜質多，且染色體易疊加成團，影響核型分析。有研究證實，通過不同時間的低滲實驗發(fā)現低滲時間20～30 min染色體分散良好，包漿去除完全[16-18]。本文通過比較10～50 min 5組低滲時間所獲得的中期細胞數，結果發(fā)現，低滲40 min后細胞膜破裂數明顯增多，高倍鏡下中期細胞數減少，低滲20 min染色體分散均勻，染色體間距適中，不易發(fā)生染色體丟失。

細胞核型制片過程中存在許多影響因素，除上述秋水仙素和細胞低滲外，空氣干濕度對烤片時間長短也有影響，空氣濕度大則烤片時間需加長，烤片后胰酶消化需嚴格秒表控制時間，否則將影響最后染色效果。制片過程中操作應輕柔，特別低滲重懸時，若力量過大細胞易破裂導致染色體丟失。因此，染色體制片是一個要求嚴格而精確的過程，掌握每個操作環(huán)節(jié)要求和規(guī)范對獲得完整細胞核型進行分析至關重要。

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（收稿日期：2015-04-09 本文編輯：王紅雙）