復(fù)合酶法提取黑木耳多糖方法優(yōu)化

鄭鈞予 丑建棟 彭曉龍 何媛媛 席麗琴 張柏林

摘要

[目的]優(yōu)化黑木耳多糖酶法提取的工藝條件。[方法]采用復(fù)合酶法提取木耳多糖，以多糖的提取率為指標(biāo)，考察了酶解溫度、酶解溶液pH、浸提料液比以及酶解時(shí)間對黑木耳多糖提取效率的影響，并采用TLC薄層色譜層析法分析提取出的黑木耳多糖的成分。[結(jié)果]試驗(yàn)確定了復(fù)合酶酶解提取黑木耳多糖的最佳工藝條件：浸提料液比1∶40 g/ml ，酶解溶液pH 7.0，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間3.0 h。在此條件下，黑木耳多糖的提取率為4.353%，所含有的單糖為D葡萄糖。[結(jié)論]研究可為黑木耳多糖的提取提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黑木耳;多糖;復(fù)合酶解;薄層層析

中圖分類號 S646.6 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-183-03

Study on Compound Enzymatic Hydrolysis of Jewsears Polysaccharides

ZHENG Junyu， CHOU Jiandong， PENG Xiaolong， ZHANG Bolin*

（College of Biological Sciences and Technology， Beijing Forestry University， Beijing 100083）

Abstract [Objective] To optimize compound enzymatic hydrolysis of Jewsears polysaccharides. [Method] With polysaccharides yield as indicator， effects of enzymatic temperature， solution pH， solidliquid ratio，enzymatic time on yield of Jewsears polysaccharides were investigated. TLC method was used to analyzed the compounds of Jewsears polysaccharides. [Result] The experiments determine the optimum conditions for enzymatic hydrolysis of Jewsears polysaccharides： leaching agent multiples is 1 to 40， pH is 7.0， temperature is 40 ℃， time is 3.0 h. Under this condition， Jewsears polysaccharides extraction rate is 4.353%. The monosaccharide composition of polysaccharides is Dglucose. [Conclusion] The study can provide reference basis for extraction of Jewsears polysaccharides.

Key words ?Jewsear; Polysaccharides; Compound enzymatic; TLC

作者簡介

鄭鈞予（1993-） ，男，廣西桂林人，本科生，專業(yè)：食品科學(xué)與工程。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事食品微生物、食品安全方向的研究。

收稿日期 20141209

黑木耳又稱云耳、黑菜，是一種質(zhì)優(yōu)的膠質(zhì)食用菌和藥用菌。我國黑木耳資源豐富，年產(chǎn)量5 000 t左右，占世界總產(chǎn)量的 90%以上，為開發(fā)應(yīng)用黑木耳提供了有利條件。黑木耳多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗癌防癌等作用^[1-3]。黑木耳中含有豐富的甘露聚糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸等碳水化合物^[4]，對人體有極大的益處。

提取多糖常用的方法有^[5-8]：熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、酶法、超聲波法、微波法等。林敏等探索出熱水浸提法提取黑木耳多糖的最佳工藝條件：黑木耳子實(shí)體干粉與水之比為1∶50，在90 ℃水浴中抽提3.5 h，提取液用70%乙醇醇析，在此工藝條件下多糖得率最高^[9]。使用此法所需浸提劑蒸餾水經(jīng)濟(jì)易取，但需多次浸提，相對于其他提取方法多糖得率依然很低，且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，效率低下。包海花等研究使用蒸餾水和1 mol/L NaOH溶液對黑木耳多糖得率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在其他條件相同的情況下，采用稀堿液浸提后不但能節(jié)省時(shí)間而且能減少原材料及試劑的消耗，提取的糖含量高，但是使用該種方法容易使多糖發(fā)生水解，破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)，且提取后液體需要中和，程序繁瑣^[10]。韓秋菊通過比較熱水浸提法、微波輔助浸提法、超聲波輔助浸提法得出結(jié)論，超聲波輔助提取法效率最高，優(yōu)于另兩種方法，但設(shè)備要求較高，提取所需溫度較高、能耗較大^[11]。姜紅等分別從浸提劑倍數(shù)、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶加量5個(gè)方面對多糖得率進(jìn)行分析，并在這5方面對比果膠酶與纖維素酶作用，發(fā)現(xiàn)在2種酶反應(yīng)體系中，最適工藝參數(shù)較為接近，為黑木耳雙酶水解提供了依據(jù)^[12]。因此，筆者采用復(fù)合酶法提取木耳多糖，并探究其最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

原料及主要試劑。黑木耳，綏芬河市維多寶食品有限公司;果膠酶，上海源葉生物科技有限公司，活性1 000 U/mg;木瓜蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，活性500 000 U/g;綠色木酶，活性11 000 U/mg上海源葉生物科技有限公司;蒽酮，北京化工廠，化學(xué)純; 硫酸、乙醇、正丁醇、三氯甲烷等化學(xué)試劑均為分析純，北京化工廠。

1.1.2

主要儀器設(shè)備。GL20GII型飛鴿牌離心機(jī);FD1冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司;DSY28電熱恒溫水浴鍋，北京國華醫(yī)療器械廠;W201B恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司;SHZIII真空抽濾機(jī)，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;722E型可見型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;JA2003上皿電子天平，上海精科天平;LD42低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

原材料預(yù)處理。 ? 剔除發(fā)霉、變質(zhì)等不合格木耳及雜質(zhì)，將干木耳粉碎，過40目篩，制成干木耳粉，置于干燥陰涼處備用。

1.2.2

復(fù)合酶法提取工藝以及工藝流程。 ? ?按照參照文獻(xiàn)^[13]的方法（有改動(dòng)）：稱取一定量經(jīng)過預(yù)處理的木耳，溶于一定體積的pH緩沖溶液中，在不同條件下保溫酶解，然后迅速升溫至90 ℃滅酶、熱水浸提2 h，將混合物離心、濃縮、乙醇沉淀，靜置過夜（10 h以上），沉淀離心分離，冷凍干燥后得到粗多糖，待測。在復(fù)溶后經(jīng)sevag法^[14]脫蛋白后冷凍干燥得精多糖。

工藝流程：黑木耳→打粉→黑木耳粉末→加酶熱浸提→高溫滅酶→抽濾→乙醇沉淀→冷凍干燥→粗多糖→溶解→sevag法除蛋白→濃縮→冷凍干燥→精多糖。

1.2.3

各因素對提取率的影響。

分別將果膠酶和纖維素酶作為水解用酶，以浸提劑倍數(shù)、pH、溫度、時(shí)間為可變因素，研究各因素對多糖得率的影響規(guī)律。在各單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上再進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

1.3 ?測定方法

采用蒽酮-硫酸法^[15-17]（有改動(dòng)）測定黑木耳多糖含量。蒽酮試劑：稱取 0.2 g蒽酮和1.0 g硫脲（阻氧化劑）置于燒杯中，緩慢加入 100 ml濃硫酸，邊加邊攪拌，溶解后呈黃色透明溶液。將其置于棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液：取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于102 ℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取0.1 g葡萄糖溶于1 L蒸餾水中，配成 0.1 mg/ml 的葡萄糖溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按表1配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在冰水浴中加入蒽酮-硫酸溶液4.00 ml，混勻，沸水浴10 min，冷卻后用分光光度計(jì)測定620 nm波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

濃度∥mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液∥μl加水量∥μl合計(jì)∥μl

001 0001 000

0.02209801 000

0.04409601 000

0.08809201 000

0.121208801 000

0.161608401 000

1.5 多糖提取液的測定

取干燥好的多糖0.01 g，配制成0.1 g/ml的多糖溶液，取多糖提取液1 000 μl于試管中，加入配制好的4 ml蒽酮-硫酸溶液，混勻，置于冷水浴10 min，沸水浴10 min，流水冷卻10 min后用分光光度計(jì)測定620 nm波長處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試驗(yàn)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程y=0.006 9x-0.015 4。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 溫度對木耳多糖提取率的影響

酶解條件為：pH 7，時(shí)間3 h，選取浸提料液比為1∶40 g/ml，酶加量（綠色木霉11 000 U+果膠酶8 000 U+纖維素酶10 000 U），提取溫度為30、40、50、60 ℃，酶解后升溫至90 ℃熱水浸提1.5 h，經(jīng)離心、濃縮、醇沉后測定多糖含量。

在酶催化反應(yīng)中，溫度是重要參數(shù)之一。隨著溫度的升高，反應(yīng)物的活化能增加，使反應(yīng)速度加快。而超過其最適溫度后，反應(yīng)速率會顯著降低，這是由于溫度過高使酶的蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致其活性降低甚至失去活性，反應(yīng)速率也會隨著溫度升高而下降。溫度過高可能會使酶失去活性，最后提取到的多糖完全是熱水浸提法得到多糖，與酶解無關(guān)。

如圖2所示，40 ℃時(shí)復(fù)合酶提取的效率最高，達(dá)到最大值后繼續(xù)升溫，提取效率反而下降，因此選擇最好的提取溫度為40 ℃。

圖2 溫度對提取效率的影響

2.3 pH對多糖得率的影響

酶解條件為：時(shí)間3 h，選取浸提料液比為1∶40 g/ml，酶加量綠色木霉11 000 U+果膠酶8 000 U+纖維素酶10 000 U，提取溫度為40 ℃，pH為5、6、7、8、9。酶解后升溫至90 ℃熱水浸提1.5 h，經(jīng)離心、濃縮、醇沉后測定多糖含量。

pH影響酶活力，適當(dāng)?shù)膒H，通過靜電作用，維持了酶活性中心的最佳三維構(gòu)象，促進(jìn)酶與底物結(jié)合;pH還會影響酶催化速度，pH不同，酶及作用底物所帶電荷不同，酶的立體構(gòu)象以及酶與底物的親和力不同，催化速度也就不同。

酶在最適pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適pH，都會降低酶活性。主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶和底物的結(jié)合;過高或過低的pH都會影響酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而使酶遭受不可逆破壞。如圖3所示，測得的最適pH為7。在此條件下，酶解的效率最高，得到的多糖量最多。

圖3 pH對多糖提取效率的影響

2.4 浸提料液比對多糖得率的影響

酶解條件為：時(shí)間3 h，選取浸提料液比為1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55 ?g/ml，酶加量綠色木霉11 000 U+果膠酶8 000 U+纖維素酶10 000 U，提取溫度為40 ℃，pH為7。酶解后升溫至90 ℃熱水浸提1.5 h，經(jīng)離心、濃縮、醇沉后測定多糖含量。