Folin睠iocalteu法測定昭通蘋果總酚含量

袁曉春 李輔碧 陳屏昭

摘要

[目的] 采用FolinCiocalteu法測定蘋果總酚含量，探索基層實(shí)驗室快速準(zhǔn)確測定蘋果總酚的有效方法，為昭通蘋果生產(chǎn)及加工工藝提供科學(xué)依據(jù)。[方法] 采用70%乙醇酸性溶液作溶劑，35 ℃下超聲提取蘋果總酚，以FolinCiocalteu試劑和120 g/L Na2CO3溶液處理，在765 nm處測其吸光度。 [結(jié)果] 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量濃度在0～125.4 mg/L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好（r=0.999 1），據(jù)此測定昭通蘋果試樣的總酚含量范圍為361.1～1 008.0 mg/kg，加標(biāo)回收率試驗結(jié)果為103.2%，RSD 1.4%。 [結(jié)論] 該方法操作簡便，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于基層實(shí)驗室。

關(guān)鍵詞昭通蘋果；FolinCiocalteu法；測定；總酚

中圖分類號S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）21-292-03

近年來，廣泛存在于蔬菜、水果、豆類、谷物類等植物中的植物多酚，因為其重要作用，而倍受人們關(guān)注。植物多酚在蘋果、葡萄、荔枝、漿果等水果中的含量極高。蘋果是多酚的主要來源，蘋果多酚具有獨(dú)特的生理功能活性，是一種有效的自由基清除劑，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景[1]。

蘋果中富含維生素、礦物質(zhì)、黃酮類、酚類等活性物質(zhì)，是一種很好的食材，無論西洋蘋果還是中國蘋果，都深受人們的喜愛。有研究表明，蘋果是荷蘭人飲食中第三大黃酮醇類物質(zhì)的食物來源，僅居于茶和洋蔥之下；在芬蘭，則與洋蔥并列第一。在美國水果酚類的22%來自于蘋果，排列第一。一系列研究表明，吃蘋果和預(yù)防許多慢性病是相關(guān)的，冠心病、慢性阻塞性肺病、腦中風(fēng)均和食用蘋果量相關(guān)。我國老百姓喜愛蘋果，普遍認(rèn)同吃蘋果時連皮吃更有營養(yǎng)。研究證明，水果果皮中的多酚含量確實(shí)比果肉中的要多。蘋果的基因型、培育條件、生長區(qū)都對蘋果多酚的濃度和清除自由基能力起到不同的作用，果皮的作用更明顯，這是因為致病的壓力大多作用于果皮[2-4]。

我國蘋果古稱為“柰”，我國史書自漢以后歷代皆有記載[4]。昭通蘋果種植歷史悠久，于1940年便被引入栽種[5]，發(fā)展至今，具有了早果、豐產(chǎn)、果面色澤鮮艷、風(fēng)味香甜濃郁、肉質(zhì)爽脆可口，成熟期較北方早30 d等特點(diǎn)。加之得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢和區(qū)位優(yōu)勢，昭通由此贏得 “蘋果之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[6]。近年來，雖然昭通蘋果產(chǎn)量大增，但在蘋果的品質(zhì)提升和加工等方面還需提高和發(fā)展。研究昭通蘋果多酚對提升昭通蘋果品質(zhì)和蘋果生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

考慮到基層實(shí)驗室人力、物力有限的現(xiàn)狀，擬定以乙醇為溶劑，利用超聲提取技術(shù)，采用FolinCiocalteu法，常溫下測定蘋果多酚。此法所需設(shè)備儀器簡單，試驗操作簡便快速。力求通過試驗，探索出基層實(shí)驗室簡單、快速、準(zhǔn)確測定蘋果總酚的有效方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

試樣。昭通本土出產(chǎn)的紅富士蘋果樣品1、2、3、4、5號（1號、2號由陳屏昭提供， 3號、4號、5號從市場分批購進(jìn)）。

1.1.2

主要試劑。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇（分析純），成都市科龍化工試劑廠；鹽酸（優(yōu)級純），西隴化工股份有限公司；FolinCiocalteu試劑（分析純），上海荔達(dá)生物科技有限公司；無水碳酸鈉（分析純），天津化學(xué)試劑三廠；水，超純水。

1.1.3

主要儀器。HR2843 Philips攪拌機(jī)，巴西制造；MS105DU電子天平，梅特勒-托利多公司；PHS828型酸度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UC7100S超聲波清洗器，美瑞泰克科技（天津）有限公司；TG16WS臺式高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV2550紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2方法

1.2.1

試劑的配制。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)配）：用電子天平稱取0.020 90 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于7.0 ml的無水乙醇中，并用水定容至100 ml，計算其濃度為209.0 mg/L。

120 g/L Na2CO3溶液：稱取120 g無水Na2CO3，溶于水并定容至1 000 ml。70%乙醇酸性溶液[7]：量取700 ml 乙醇，加水稀釋定容至1 000 ml，并滴加鹽酸，調(diào)節(jié)溶液酸度至pH 4.30。

1.2.2

試驗條件的選擇。

1.2.2.1

選擇試驗波長。準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀釋，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和一定體積的120 g/L Na2CO3溶液，定容搖勻，25 ℃下反應(yīng)一段時間，于不同波長處測其吸光度。

1.2.2.2

選擇顯色條件。綜合文獻(xiàn)資料[7-18]和基層實(shí)驗室條件，通過試驗選擇測定蘋果多酚的顯色條件：準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀釋，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和不同體積的120 g/L Na2CO3溶液，定容搖勻。25 ℃下反應(yīng)一段時間后，每間隔15 min，于“1.2.2.1”試驗確定的波長處，分別測定其吸光度。依據(jù)試驗結(jié)果，確定Na2CO3溶液用量及顯色時間。

1.2.3

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確移取不同體積的209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.2”進(jìn)行試驗，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4

測定蘋果多酚總量。將蘋果樣品洗凈后用不銹鋼刀具切開，撿出果籽并記錄蘋果籽顏色，后將剩余部分（包括果核、果皮）切成5 mm以下的碎塊，混勻后稱取100 g放入攪拌瓶，加水100 ml后破碎60 s，制成勻漿[12]。準(zhǔn)確稱取該勻漿10 g，以70% 乙醇酸性溶液定容至100 ml，35 ℃下超聲提取40 min，冷卻，用干燥濾紙過濾；準(zhǔn)確移取濾液1.00 ml，按照“1.2.2”進(jìn)行試驗，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中蘋果多酚含量。

1.2.5

方法評價。按“1.2.4”試驗方法進(jìn)行以下試驗。①重復(fù)性試驗：從同一批樣品中隨機(jī)抽取5個蘋果，分別制成勻漿后測其吸光度，計算總酚及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。②精密度試驗：對同一蘋果樣品待測試液的吸光度平行測定5次，計算總酚及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。③加標(biāo)回收率試驗：向已知蘋果多酚含量的樣品試液中，分別加入一定體積的 209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其吸光度，并計算其總酚回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定測試波長

準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀釋，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液，定容搖勻，25 ℃下反應(yīng)60 min，于700～800 nm波長范圍內(nèi)測其吸光度。

由表1表明，在765 nm處吸光度最大，確定765 nm為該試驗的測定波長。

2.2反應(yīng)條件的確定

2.2.1

確定Na2CO3用量。準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀釋，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和不同體積的 120 g/L Na2CO3溶液，定容搖勻，25 ℃下反應(yīng)60 min，于765 nm波長處測其吸光度。

另取蘋果試液在相同條件下進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)Na2CO3用量在4.00 ～ 8.00 ml范圍內(nèi)，試液出現(xiàn)少量白色沉淀；Na2CO3用量大于8.00 ml以后，白色沉淀較多（表2），這與文獻(xiàn)資料的結(jié)果一致[13]?？紤]到白色沉淀的生成將影響吸光度測定，少量白色沉淀量影響較小，因此確定120 g/L Na2CO3用量為8.00 ml，并且在測定蘋果多酚時，先將顯色試液進(jìn)行離心處理，再測定吸光度。

2.2.2

確定顯色時間。

準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀釋，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液，定容搖勻，25 ℃下反應(yīng)15 min后開始，于765 nm波長處測定其吸光度，每間隔15 min測定一次。表3表明，顯色反應(yīng)在60 min后的吸光度趨于穩(wěn)定。

由此確定此次試驗的反應(yīng)條件：FolinCiocalteu試劑用量為1.00 ml，120 g/L Na2CO3 用量為8.00 ml，25 ℃下顯色60 min。

2.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀釋，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液，定容搖勻， 25 ℃下反應(yīng)60 min，于765 nm處測定其吸光度（表4）。

據(jù)此以吸光度對沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作圖，總酚含量在0～125.4 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性計算公式y(tǒng)=0.005 4x+0.013 6，r=0.999 1。

2.4 方法評價

2.4.1

重復(fù)性試驗。分別從1號、3號蘋果樣品中，隨機(jī)抽取5個蘋果，按照“1.2.4”的方法試驗并計算。由表5可見，1號蘋果總酚平均含量384.5 mg/kg，RSD 4.0%；3號蘋果總酚平均含量968.1 mg/kg，RSD 3.6%。

2.4.2

精密度試驗。對4號蘋果試液平行5次測定吸光度并計算，得到5次測定總酚含量分別為792.1、788.6、802.5、806.0、809.5 mg/kg，平均

799.7 mg/kg，RSD 1.1%。

2.4.3

穩(wěn)定性試驗。選用3號蘋果試液，在完成測定后的下列各時間段，再測定其吸光度并計算。試驗得出，在10、20、30、40、50、60 min時，總酚含量依次為1 008.0、1 012.0、1 015.0、1 022.0、1 018.0、1 015.0 mg/kg，RSD 0.5%。

2.4.4

加標(biāo)回收率試驗。準(zhǔn)確吸取4號蘋果試液0.50 ml，分別加入0.15、0.20、0.25 ml 的209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.4” 試驗方法測定其吸光度并計算，結(jié)果見表6。

試驗數(shù)據(jù)表明，該試驗方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率較好。

2.5試樣蘋果多酚的測定

從1、2、3、4、5號樣品中隨機(jī)抽取2個[8]，按照“1.2.4”試驗方法測定并計算，得出1號蘋果樣品中總酚含量分別為402.2、361.1 mg/kg，2號蘋果樣品總酚含量分別為466.0、452.3 mg/kg，3號蘋果樣品總酚含量分別為1 008.0、912.7 mg/kg，4號蘋果樣品總酚含量分別為792.1、808.0 mg/kg，5號蘋果樣品總酚含量分別為

6308、651.8 mg/kg。此次試驗試樣的蘋果多酚含量范圍361.1～1 008.0 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

采用70%乙醇酸性溶液作溶劑，35 ℃下超聲提取蘋果總酚，以FolinCiocalteu法測定蘋果總酚的反應(yīng)條件：FolinCiocalteu試劑用量1.00 ml ，120 g/L Na2CO3 用量8.00 ml，25 ℃下顯色60 min。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)，在0～125.4 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（y=0.005 4x+0.013 6，r=0.999 1）。方法簡單、快速、準(zhǔn)確，適用于基層實(shí)驗室測定蘋果多酚。

樣品1號和2號著色淺紅，甜脆，采摘后低溫保存約25 d；3號著色紅黑，果肉有些許澀味，采摘后低溫保存約30 d；4號和5號著色紅色，甜脆，采摘后低溫保存約3 d。試驗結(jié)果表明，果面著色較深、果籽顏色較深、果子澀味較濃、采摘后保存時間較短的蘋果，其總酚含量較高。樣品的蘋果總酚含量范圍：361.1～1 008.0 mg/kg，差別較大；這與蘋果品種、生長條件、采摘時間、成熟度、保存方法等因素有關(guān)。此試驗結(jié)果與國內(nèi)外文獻(xiàn)資料相符[19-21]。

1號樣品經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理，2號樣品為其對照品，1號樣品的總酚含量稍低于2號樣品。亞硫酸氫鹽對云南昭通紅富士蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的影響較大，能有效促進(jìn)果實(shí)增產(chǎn)，改善果實(shí)外觀品質(zhì)，提升果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)（如提高維生素C的含量等）[22-23]。但是維生素C的含量會隨著蘋果貯存時間的延長而降低。趙曉娟等的研究表明，在測定蘋果醋飲料總酚時，添加維生素C后的吸光度比對照品的吸光度有較明顯的增加[24]。因此，在測定蘋果多酚時，不能忽視樣品中存在的維生素C對測定的影響。維生素C含量高低對測定蘋果多酚的影響程度還需進(jìn)一步研究。

蘋果果肉、果皮、葉子中酚類的類別和質(zhì)量構(gòu)成了蘋果飲食的健康功效，深入了解蘋果酚類動態(tài)變化有助于育種計劃的制定[25]。測定蘋果多酚并掌握其變化情況，對進(jìn)一步提高蘋果品質(zhì)具有重要意義。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

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