原代培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的甘草毒性研究

孫新明，楊亞軍

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西吉安343000)

不孕不育癥是全球性復(fù)雜的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問題之一。隨著工業(yè)的日益發(fā)達(dá)及對(duì)環(huán)境污染控制的相對(duì)不足和臨床藥物濫用，男性因素所引發(fā)的不育不孕癥發(fā)生率越來越高而逐漸引起人們的重視［1-3］;長(zhǎng)期以來，甘草等植物中草藥及其復(fù)方常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥得以廣泛應(yīng)用。但近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，不少臨床常用的中藥如甘草、補(bǔ)骨脂等可促進(jìn)雌性動(dòng)物乳腺發(fā)育和子宮明顯增質(zhì)量及血清雌激素水平升高［4］，但其雌激素樣作用是否與環(huán)境雌激素一樣具有男性生殖毒性作用?特別是甘草對(duì)男性生殖系統(tǒng)的毒性作用目前尚未見細(xì)胞毒性研究。鑒于此，本研究從甘草對(duì)雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)及其分泌睪酮的影響入手研究甘草對(duì)睪丸的生殖毒性，為甘草等具有雌激素樣作用中藥材的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料清潔級(jí)BABL/c雄鼠10只(購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司);市售藥用甘草采用超聲提取法和樹脂吸附技術(shù)自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/mL)后用PBS溶液配制成10 mg/mL藥物濃度，過濾除菌，置冰箱冷藏備用;

1.2 主要試劑DMEM、DMEM/F12、小牛血清、苔盼藍(lán)購(gòu)于GIBCO公司;膠原酶、透明質(zhì)酸酶、perooll分離液、Hepes購(gòu)于SIGMA公司;胰蛋白酶購(gòu)于AMRESCO公司;HE染色液、PBS、D-hanks液培養(yǎng)基均為自制試劑;其他常規(guī)普通試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 甘草對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)取4～5周齡22～25 g的BABL/c雄鼠10只，按照邵冰玉等報(bào)道的方法［5］分離得到睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度(3～5×105個(gè)/mL)接種于24孔培養(yǎng)板，在10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、飽和濕度)中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h換液。

1.3.2 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外藥物毒性實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)貼壁(記為0)后進(jìn)行以下分組實(shí)驗(yàn):一組為不給藥對(duì)照組，另一組為給藥實(shí)驗(yàn)組。對(duì)實(shí)驗(yàn)組先用MTT法［6］確定甘草提取物對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外毒性的IC50值和最低毒性劑量，以細(xì)胞存活率為80%±的藥物濃度為細(xì)胞最低毒性劑量;細(xì)胞存活率%=(加藥細(xì)胞OD-本地OD/對(duì)照細(xì)胞OD－本地OD)×100%(本底OD值為酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)無細(xì)胞的完全培養(yǎng)基加MTT的光密度值);以IC50值和最低毒性劑量作為高、低兩個(gè)劑量藥物濃度，加入0.5 mL藥液于培養(yǎng)的0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的0、12、24 h、48 h對(duì)各組培養(yǎng)貼壁細(xì)胞進(jìn)行H-E染色后光鏡觀察。

1.3.3 睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮水平的測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒使用說明測(cè)定1.3.2項(xiàng)中各試驗(yàn)組在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的0、12、24、48 h時(shí)培養(yǎng)液中睪酮水平。

2 結(jié)果

2.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 MTT法測(cè)定甘草提取物對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 MTT法測(cè)定甘草提取物對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性結(jié)果

MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，甘草提取物對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的體外毒性IC50=275 μg/mL，最低毒性劑量為10 μg/mL，即給藥組的高、低劑量質(zhì)量濃度分別為275 μg/mL和10 μg/mL。

2.1.2 甘草提取物對(duì)間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果對(duì)分離到的睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)6 h后細(xì)胞開始發(fā)生極化，偶有貼壁。培養(yǎng)48 h后(0 h)多數(shù)細(xì)胞貼壁，對(duì)進(jìn)一步培養(yǎng)的各組細(xì)胞進(jìn)行H-E染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，剛貼壁的細(xì)胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞間以其突起形成網(wǎng)絡(luò)狀連接，輪廓不清(見圖1)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，在對(duì)照組細(xì)胞輪廓成為多角形或不規(guī)則形狀，有3～4個(gè)突起伸出，至進(jìn)一步培養(yǎng)48 h后間質(zhì)細(xì)胞呈多邊形或長(zhǎng)梭形，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多而變得越來越密集，但細(xì)胞界限越清晰，細(xì)胞間有空隙且排列無極性(圖2C～4C);在給藥實(shí)驗(yàn)組，則隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)變差，貼壁細(xì)胞形態(tài)變化與對(duì)照組相同，但與對(duì)照組形成鮮明對(duì)比的是，細(xì)胞的密度變得越來越稀疏，表明細(xì)胞生長(zhǎng)分裂受到抑制，有些貼壁細(xì)胞發(fā)生凋亡，在給藥培養(yǎng)48 h顯得尤為明顯，這種變化在高濃度給藥實(shí)驗(yàn)組比低濃度給藥實(shí)驗(yàn)組更為突出(見圖2～4)。

圖1 培養(yǎng)48 h貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，H-E×200

圖2 對(duì)照組培養(yǎng)貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h(2C)、24 h(3C)和48 h(4C)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，H-E×200

圖3 高濃度給藥組培養(yǎng)貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h(2H)、24 h(3H)和48 h(4H)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，H-E×200

圖4 低濃度給藥組培養(yǎng)貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h(2L)、24 h(3L)和48 h(4L)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，H-E×200

2.1.3 培養(yǎng)液中睪酮水平檢測(cè)結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中睪酮水平，結(jié)果見圖5。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h及48 h后培養(yǎng)液中睪酮水平，在對(duì)照組、低劑量組和高劑量組間兩兩比較差異均極為顯著(P＜0.01)。

圖5 在各藥物濃度下培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中睪酮水平

3 討論

關(guān)于植物雌激素對(duì)雄性動(dòng)物的影響有較多研究報(bào)道認(rèn)為，給雄性動(dòng)物喂飼含異黃酮類雌激素的植物可促進(jìn)睪丸增重和血清睪酮含量，并促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管明顯增大，初級(jí)精母細(xì)胞形成提前，即具有促進(jìn)雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用［7］，因而表現(xiàn)出與環(huán)境雌激素對(duì)雄性個(gè)體完全不一樣的作用［8］。但植物雌激素對(duì)睪丸細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響和中草藥雌激素樣作用對(duì)睪丸毒性的研究報(bào)道并不多。朱鋒榮等［9］的研究認(rèn)為，植物雌激素(染料木素)在低濃度下(0.1 μmol/L)給藥時(shí)可顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，但當(dāng)植物雌激素濃度大于5 μmol/L時(shí)，卻顯著抑制間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌。有研究認(rèn)為，苦參可使精子瞬間失活的最低有效質(zhì)量濃度為0.85～3.15 g/L，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)精子有致死作用，而蘆薈對(duì)雄性鼠性腺、精液有一定的影響，使雌性小鼠的妊娠率降低，畸胎率升高［10］。

甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、緩急、止痛等功效。常用于脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸短、咳嗽痰多、脘脹、四肢攣急、疼痛、癰腫瘡、緩解藥物毒性等。中醫(yī)界自古有“十方九草”之說［11］。因此，甘草常作為中藥材食品添加物及臨床常用藥物得以廣泛應(yīng)用，其主要化學(xué)成分是甘草甜素、甘草次酸。中藥藥理學(xué)認(rèn)為，大劑量的甘草甜素有雌激素樣作用，而甘草次酸具有抑制雄性小鼠生殖腺產(chǎn)生睪酮的作用［12］，但其是否與其他含異黃酮類雌激素的植物對(duì)男性生殖系統(tǒng)具有類似的作用?目前未見詳細(xì)研究報(bào)道。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞也稱為L(zhǎng)eydig細(xì)胞，是合成和分泌雄激素(睪酮)的主要場(chǎng)所，其分泌的雄激素可結(jié)合支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白而維持生精小管內(nèi)較高的雄激素濃度，以促進(jìn)生精小管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞的增殖、發(fā)育，因此睪丸間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間關(guān)系密切，其生存狀態(tài)及分泌睪酮的功能活動(dòng)可在很大程度上影響、甚或體現(xiàn)睪丸的生殖活動(dòng)［13］。因此，睪丸間質(zhì)細(xì)胞也通常作為研究藥物對(duì)睪丸分泌睪酮作用的體外模型［14］。但睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離純化一直是國(guó)際上進(jìn)行深入研究的瓶頸。本研究應(yīng)用邵冰玉等［5］的方法分離純化小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，因?yàn)樗麄儜?yīng)用17-α羥化酶mRNA擴(kuò)增表明培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞具有較高純度。此外，本研究中對(duì)分離到的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后HE染色鏡檢，形態(tài)變化與劉玉志等［15］報(bào)道的相同，因此在本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)相同方法分離培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。另外，本研究選用4～5周齡成年小鼠，此時(shí)睪丸中間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和分泌能力均達(dá)到高峰［16］，便于研究藥物對(duì)間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的影響。本研究結(jié)果顯示，超過10 μg/mL甘草提取物濃度對(duì)體外原代培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和睪酮分泌均具有顯著抑制作用，且隨藥物濃度增加和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用越加明顯。需要提及的是，本研究用的自制甘草浸膏所含的甘草提取物中除了具有對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有影響的甘草甜素、甘草次酸等藥效成分外，還含有多種非療效成分。本研究采用超聲提取法和樹脂吸附技術(shù)將藥用甘草自制成浸膏，浸膏中無甘草成分以外的其他對(duì)細(xì)胞有害的成分，也沒有將甘草中的其他非療效成分去除，結(jié)果雖然不能完全反應(yīng)僅為甘草中甘草甜素或甘草次酸對(duì)雄性的毒性作用，這是本研究存在的一個(gè)缺陷。但我們認(rèn)為，這樣制成的甘草浸膏更能反應(yīng)甘草對(duì)男性生殖的毒性。欲知非療效成分對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的毒性，可能還需進(jìn)一步分離甘草中非療效化合物對(duì)睪丸細(xì)胞毒性進(jìn)行追蹤研究。但可以肯定的是，在進(jìn)行細(xì)胞體外研究時(shí)，甘草浸膏的最低毒性劑量?jī)H為10 μg/mL，而甘草中主要化學(xué)成分是甘草甜素和甘草次酸，故其受試物中療效成分的含有量已較低，非療效成分含有量更低，因而也不會(huì)對(duì)雄性生殖細(xì)胞產(chǎn)生很大的毒性。

然而，僅憑在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中添加藥物所表現(xiàn)出的對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用很難斷定該藥物對(duì)在體睪丸具有生殖毒性作用，要確切了解甘草對(duì)睪丸的生殖毒性作用，需要進(jìn)一步研究甘草對(duì)在體睪丸的毒性作用。

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