誘發(fā)枇杷霜凍害的冰核細(xì)菌拮抗菌分離與篩選

邱春錦　彭建平　鄭國棟

摘要 [目的]篩選出具有防除枇杷INA細(xì)菌的拮抗菌。[方法]從枇杷根際土壤中分離冰核細(xì)菌拮抗菌，對其進(jìn)行抑菌圈、殺菌能力、破壞冰核活性蛋白能力測定。[結(jié)果]從不同海拔地區(qū)的根際土壤中共分離得到128個(gè)菌株，其中有拮抗效果的有55株，平皿拮抗效果強(qiáng)的有15株，再經(jīng)拮抗系數(shù)比較得到9株強(qiáng)拮抗菌菌株，最后篩選出1株殺菌率達(dá)98%、破壞冰核蛋白能力達(dá)100%的拮抗菌BL36。[結(jié)論]BL36既有殺菌效果又有破壞冰核蛋白能力，是具有較好利用前景的防除誘發(fā)枇杷霜凍害冰核細(xì)菌、減輕枇杷霜凍害的生物防治材料。

關(guān)鍵詞 枇杷；拮抗菌；冰核細(xì)菌；抑菌圈法；殺菌能力；破壞冰核蛋白能力

中圖分類號 S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-168-03

Abstract [Objective] The aim was to screen out antagonistic bacteria to control ice nucleation active bacteria （INA） which induced loquat frost. [Method] INA antagonistic bacteria was screened out from rhizosphere soil of loquat， and then inhibition zone， inhibition ability and the damage of ice nucleation active protein were determined. [Result] Results showed that 128 strains were isolated from the rhizosphere soil at different altitudes， among 55 strains had antagonistic effect， 15 strains had strong antagonistic effect. Then through the comparison of antagonistic coefficient， 9 strains with strong antagonistic bacteria were acquired. One strain of antagonistic bacterium named BL36 was screened out finally； its bactericidal rate reached 98%， and the damage of ice nucleation active protein reached 100%. [Conclusion] BL36 had both bactericidal effect and damage of ice nucleation active protein， and was a biological control of materials which could control INA and reduce loquat frost， so it had a good utilization prospect.

Key words Loquat； Antagonistic bacteria； INA； Inhibition zone method； Bactericidal effect； Damage of ice nucleation active protein

枇杷是原產(chǎn)我國的一種兼具營養(yǎng)和保健功效的水果。枇杷秋花冬果，在福建省閩中地區(qū)其幼果期適逢一年中最冷的月份，一場霜凍害能在短短的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)造成大面積減產(chǎn)甚至絕收[1-4]。長期以來，人們一直認(rèn)為霜凍僅是低溫對植物脅迫作用所造成的危害，王慧等指出冰核細(xì)菌（簡稱INA細(xì)菌）是誘發(fā)枇杷幼果凍害的主要因素[5]。冰核細(xì)菌能夠破壞水的過冷卻狀態(tài)，在-3.0～-1.0 ℃誘發(fā)植物細(xì)胞間水結(jié)冰而發(fā)生霜凍[6-12]。國內(nèi)外學(xué)者已開始從自然界植物體上的多種微生物中篩選對INA細(xì)菌有拮抗作用、營養(yǎng)競爭能力強(qiáng)、抑殺或寄生性強(qiáng)的微生物菌株，對其進(jìn)行了人工生產(chǎn)繁殖，再噴灑在植物體上，以期控制或殺滅INA 細(xì)菌，達(dá)到防御霜凍的目的[13-16]。Lindow 從玉米上分離到一種M232A 拮抗菌，處理霜凍指數(shù)比對照降低了30.8，處理株高為1.5 m的田間玉米，當(dāng)發(fā)生氣溫為-2.5～-1.5 ℃的霜凍時(shí)，處理霜凍指數(shù)為0.8，而對照霜凍指數(shù)高達(dá)2.1，防效十分顯著[17]。目前關(guān)于分離拮抗菌防除冰核細(xì)菌減輕霜凍害的研究已有較多報(bào)道，但在枇杷上尚屬空白。鑒于此，筆者從枇杷根際土壤中分離冰核細(xì)菌拮抗菌，采用抑菌圈測定、殺菌能力測定、破壞冰核活性蛋白能力測定等方法篩選具有防除枇杷INA細(xì)菌的拮抗菌，旨在為降低由冰核細(xì)菌誘發(fā)的枇杷霜凍害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。INA細(xì)菌L4菌株分離自福建省莆田市鐘山鎮(zhèn)霜凍害發(fā)生區(qū)的田間枇杷花瓣上，經(jīng)檢測具有冰核活性菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基。KB培養(yǎng)基配方見文獻(xiàn)[2]；PSA培養(yǎng)基配方見文獻(xiàn)[18]。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌分離。

1.2.1.1 取樣。選擇高海拔地區(qū)莆田仙游縣（660 m）、福州晉安區(qū)（550、400 m），中海拔地區(qū)莆田荔城區(qū)（250 m）、莆田城廂區(qū)（350 m），低海拔地區(qū)莆田涵江區(qū)（50、100 m）、福州鼓樓區(qū)（10 m）、浙江德清縣（100 m）霜凍害發(fā)生頻繁的枇杷產(chǎn)區(qū)，在枇杷不同部位及根圍土壤中取樣。

1.2.1.2 樣品處理。取1.0 g根圍土或1.0 g新鮮葉片或葉芽磨碎加入9.0 ml無菌水于三角瓶中，振蕩10 min，稀釋至梯度濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7 g/ml，分別取0.1 ml各濃度稀釋液均勻涂抹于PSA培養(yǎng)基上，在22 ℃下培養(yǎng)36 h，挑選所有不同特征菌落，點(diǎn)接于混有INA細(xì)菌L4的KB平板上。測定抑菌圈半徑，3次重復(fù)。

1.2.2 抑菌圈測定。

取0.2 ml 3.0×108cfu/ml INA細(xì)菌L4菌液放入培養(yǎng)皿內(nèi)，對孫福在等的抑菌圈法進(jìn)行改進(jìn)[19]，測量抑菌圈、菌落、抑菌帶半徑，觀察透明度等，重復(fù)3次。

1.2.3 殺滅INA細(xì)菌能力測定。

復(fù)篩的9個(gè)菌株分別在PSA斜面培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h，INAL4細(xì)菌在KB斜面培養(yǎng)基上22 ℃培養(yǎng)36 h，備用。將培養(yǎng)好的拮抗菌和INA細(xì)菌配成濃度均為3.0×108cfu/ml的菌液，各取5.0 ml菌液配制成混合液。將混合液放入4 ℃冰箱中[5]，5 h后各取1.0 ml混合液按照1∶1×105、1∶1×106、1∶1×107的比例稀釋，各取0.2 ml稀釋液于KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并設(shè)INA細(xì)菌原液為對照，重復(fù)3皿，在22 ℃下培養(yǎng)3 d，觀察記錄冰核細(xì)菌的菌落數(shù)量。處理完畢后，立即放入4 ℃冰箱中24 h，再測定冰核細(xì)菌的菌落數(shù)量。

1.2.4 破壞冰核蛋白能力測定。

采用Lindow等改進(jìn)的小液滴凍結(jié)法測定冰核活性[8]。配制混合液方法同“1.2.3”。用微量加樣器吸取0.2 ml細(xì)菌懸浮液，滴加到-5.0 ℃的測試表面上，每滴0.1 ml，每種菌液滴10滴，重復(fù)2次。以無菌水和INA細(xì)菌L4 3.0×108 cfu/ml作對照。用低溫恒溫槽測定凍滴數(shù)。在2 min內(nèi)記下凍滴數(shù)，換算成凍滴率和破壞率。探針驗(yàn)證小液滴是否凍結(jié)以第1次結(jié)果為準(zhǔn)。

凍滴率=凍結(jié)個(gè)數(shù)/試驗(yàn)總個(gè)數(shù)×100%

破壞率=不凍結(jié)個(gè)數(shù)/試驗(yàn)總個(gè)數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 分離到的菌株對INA細(xì)菌的抑菌能力測定

從9個(gè)不同地區(qū)和海拔的枇杷根際土樣、枇杷不同部位上分離純化128個(gè)菌株。發(fā)現(xiàn)55個(gè)菌株對INA有抑菌效果。對INA細(xì)菌有抑菌效果的55個(gè)菌株中，抑菌圈半徑大于10 cm的有15株，占11.7%；抑菌圈半徑大于5 cm且小于10 cm的有22株，占17.2%；抑菌圈半徑大于0且小于5 cm的有18株，占14.0%。沒有拮抗作用的菌株有73株，占57.0%。拮抗菌株獲得率為43.0%。具拮抗能力的55個(gè)菌株中，強(qiáng)菌株占27.3%，中強(qiáng)菌株占40.0%，弱菌株占32.7%。根據(jù)拮抗菌抑菌圈半徑大、增殖速度快、抑菌帶清晰程度等特點(diǎn)要求，最終確定了9個(gè)菌株作為復(fù)篩試驗(yàn)對象，分別為BL36、BL27、BL33、BL30、BL43、BL28、BL31、BL35和BL38。

2.2 拮抗菌對INA細(xì)菌抑菌作用比較

INA細(xì)菌與抑菌帶接觸的菌落邊緣厚，而對照INA細(xì)菌生長正常，菌落鋪展整個(gè)平板，說明這些拮抗菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對INA菌落的擴(kuò)展均具有較強(qiáng)的抑制作用。由表2可知，BL36拮抗系數(shù)達(dá)1.28，抑菌圈半徑為27.2 mm，抑菌帶寬度為6.0 mm，表現(xiàn)都是最佳，抑菌效果好于其他8個(gè)拮抗菌，達(dá)到極顯著水平。BL43、BL35等6個(gè)拮抗菌的拮抗系數(shù)沒有差異，但抑菌圈半徑、抑菌圈寬度、拮抗菌半徑之間差異大，無法直接進(jìn)行利用。

2.3 不同拮抗菌對枇杷INA細(xì)菌的殺菌作用

9個(gè)拮抗菌與枇杷INA細(xì)菌L4按照1∶1的比例混合后，在4 ℃冰箱中處理5 h后，BL33對INA細(xì)菌的殺菌率達(dá)到98.5%，BL36的殺菌率達(dá)到98.0%，殺菌效果較好。處理24 h后，BL33、BL36的殺菌率達(dá)100%；拮抗菌BL36、BL33的殺菌效果好于其他7個(gè)拮抗菌，差異達(dá)到極顯著水平。由表2和表3綜合分析得出：第一，INA拮抗菌對INA細(xì)菌的殺菌作用與產(chǎn)生的抑菌圈大小無關(guān)。如菌株BL27等，抑菌圈較大但對INA細(xì)菌的殺菌作用與其他的拮抗菌比較卻相對較弱。第二，BL38、BL28等4個(gè)拮抗菌的殺菌效果隨著時(shí)間的延長，殺菌率反而下降，該4個(gè)菌株的殺菌有效期短。其三，除了BL33、BL36的殺菌率達(dá)100%外，其他7個(gè)拮抗菌殺菌都不徹底，不能直接應(yīng)用。綜上所述，拮抗菌BL36、BL33是殺滅冰核活性細(xì)菌良好的生物防治菌株。

2.4 不同拮抗菌破壞枇杷INA細(xì)菌冰核活性結(jié)果

對放置5和24 h的混合液于-5 ℃下測定凍滴率。由表4可知，處理5 h后，9個(gè)拮抗菌菌株與INA細(xì)菌的混合液都有不同程度的凍結(jié)現(xiàn)象，其中，BL36的凍滴率為20%，破壞率為80%，效果最佳；BL33、BL38 等4個(gè)菌株的凍滴率為40%，破壞率為60%；拮抗菌的破壞率達(dá)50%以上。24 h后，BL36、BL33的凍滴率均為10%，破壞率為90%；BL36、BL33等3個(gè)拮抗菌對冰核蛋白的破壞率隨著時(shí)間的延長而提高。BL31、BL35破壞冰核蛋白能力均隨著時(shí)間的延長而有所下降。綜上所述，BL36在5和24 h的破壞能力都是最好的。

3 結(jié)論與討論

針對誘發(fā)枇杷霜凍害的冰核細(xì)菌，從枇杷根際土壤分離到55個(gè)拮抗菌，說明自然界普遍存在著INA細(xì)菌拮抗菌。根據(jù)增殖速度快、抑菌帶寬且清晰程度高的拮抗菌株篩選要求，選出BL36、BL33、BL27等9個(gè)強(qiáng)拮抗菌菌株。對INA細(xì)菌殺菌能力測定發(fā)現(xiàn)處理5和24 h后，BL36的殺菌能力較好且穩(wěn)定；用VaLi法測定破壞冰核蛋白能力發(fā)現(xiàn)BL36在5和24 h破壞冰核活性能力都是最好， BL33次之。拮抗菌BL36在爭奪生存空間和營養(yǎng)、殺滅冰核活性細(xì)菌、降低冰核蛋白數(shù)量3個(gè)方面綜合效果最佳。

拮抗菌對INA細(xì)菌主要通過爭奪生存空間和營養(yǎng)來抑制冰核細(xì)菌的數(shù)量，相應(yīng)降低冰蛋白的數(shù)量來達(dá)到抑菌防御霜凍的目的，由于生防菌增殖和擴(kuò)展要有一個(gè)過程，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)與藥劑復(fù)配使用，才能更好地防除冰核細(xì)菌，減輕枇杷霜凍害。

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