小鼠NF—κBp65亞基真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

楊雪梅　吳靖萱　屈瑋

摘要 [目的] 構(gòu)建小鼠NFκB p65亞基真核表達(dá)質(zhì)粒。 [方法] 擴(kuò)增NFκB p65亞基，然后構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒（mNFκBp65pEGFPC1），并通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒中p65亞基的正確性；然后提取無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過(guò)觀測(cè)重組蛋白所融合的綠色熒光蛋白，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。[結(jié)果] PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增了小鼠NFκB p65亞基，成功構(gòu)建了小鼠NFκB p65亞基的真核表達(dá)質(zhì)粒，將其命名為mNFκBp65pEGFPC1。在真核細(xì)胞中，重組質(zhì)粒可以成功表達(dá)小鼠NFκB p65亞基融合綠色熒光蛋白的目的蛋白。[結(jié)論] 重組質(zhì)粒NFκBp65pEGFP構(gòu)建成功，為后續(xù)開展NFκB信號(hào)通路的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 NFκB；p65；重組質(zhì)粒；真核表達(dá)

中圖分類號(hào) S865.1+3；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 05176611（2015）20-038-03

Abstract [Objective] To construct mice NFKB p65 subunit eukaryotic expression plasmid. [Method] The NFκB p65 subunit was amplified by PCR， and then digested and ligated to pEGFPC1. The recombined plasmid was termed mNFκBp65pEGFPC1， and validated by enzyme digestion and PCR. Finally， we purified the endotoxinfree plasmid DNA， and transfected it into the HepG2 cells. The expression of NFκB p65 subunit was assayed by observing the fusion GFP protein. [Results] The electrophoresis results indicate that we have successfully obtained the NFκB p65subunit gene， and constructed the mice NFκB p65 subunit eukaryotic expression plasmid. After transfection into HepG2 cells， the recombined protein expressed successfully. [Conclusion] The mice NFκB p65 subunit eukaryotic expression plasmid was constructed successfully， which is important for the further study of NFκB signal in macrophage.

Key words NFκB； p65； Recombinant plasmid； Eukaryotic expression

肥胖正在全球范圍迅速蔓延，肥胖增加了個(gè)體罹患心血管疾病、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎和某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅著人類健康[1-3]。肥胖過(guò)程中，脂肪組織增大所導(dǎo)致的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性因子分泌增加，以及游離脂肪酸增多，引起了低度的慢性炎癥，這一慢性炎性是引起肥胖相關(guān)代謝疾病的重要原因[4]。NFκB信號(hào)通路在調(diào)控炎性及壓力應(yīng)答中起了核心作用，外界病原菌侵入或內(nèi)部壓力會(huì)在大多數(shù)細(xì)胞中激活NFκB信號(hào)通路，此外NFκB信號(hào)還與癌癥的發(fā)生相關(guān)[5]。最近的研究表明，NFκB信號(hào)通路與胰島素抵抗的形成密切相關(guān)[6-8]。在哺乳動(dòng)物中，NFκB轉(zhuǎn)錄因子家族包含5個(gè)蛋白：p65（RelA）、RelB、cRel、p105/p50 （NFκB1）以及p100/p52 （NFκB2），這些蛋白具有保守的RHD結(jié)構(gòu)域，可以形成同源或異源復(fù)合物調(diào)控轉(zhuǎn)錄。p50/65異源二聚體是最主要的Rel二聚體，在NFκB信號(hào)通路中扮演了重要角色[9-11]。

為了進(jìn)一步研究NFκB調(diào)控巨噬細(xì)胞影響脂肪組織炎性中的作用，筆者擬構(gòu)建小鼠NFκB p65亞基的真核表達(dá)質(zhì)粒。小鼠的p65基因mRNA全長(zhǎng)1 740 bp，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 650 bp，共編碼549個(gè)氨基酸。構(gòu)建的小鼠p65真核表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)探究其對(duì)于NFκB p65亞基的調(diào)控，及其調(diào)控脂肪組織炎性的相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RNA提取試劑TRIzol和反轉(zhuǎn)錄酶Reverse Transcriptase MMLVG購(gòu)自Invitrogen公司， 限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒和Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司；pEGFPC1質(zhì)粒和HepG由合肥工業(yè)大學(xué)肥胖與代謝疾病研究所保藏；DNA純化試劑盒購(gòu)自Axygen公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司；胎牛血清（FBS）、optiMEM和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；Lipofecta mine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠NFκB p65亞基引物設(shè)計(jì)。

通過(guò)NCBI找到GenBank中NFκB p65亞基序列，序列編號(hào)為GI：M61909.1。根據(jù)其mRNA中的編碼區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（加粗處），引物序列如下：上游引物為5 CCCTCGAGATGGACGATCTGTTTCCCCT 3（引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)）；

下游引物為5 CCCAAGCTTTTAGGAGCTGATCTGACTC 3 （引入HindⅢ酶切位點(diǎn)）。引物由Invitrogen公司（上海）合成。

1.2.2 小鼠NFκB p65亞基擴(kuò)增。

取小鼠肝臟，剪碎后利用TRIzol提取總RNA，驗(yàn)證RNA完整性及純度后，再利用反轉(zhuǎn)錄酶MMLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的上下游引物擴(kuò)增小鼠NFκB p65亞基的ORF序列。反應(yīng)體系為50 μl： rTaq酶0.25 μl，10× PCR Buffer 5 μl，dNTP 4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA模板1 μl，滅菌水37.75 μl。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共3個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共27個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 小鼠NFκB p65亞基真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

將上述PCR產(chǎn)物（包含NFκB p65亞基的開放讀碼框）和pEGFPC1載體，使用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳后再利用DNA純化試劑盒純化DNA。然后用DNA連接試劑盒連接NFκB p65亞基和pEGFPC1載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，挑取菌落，PCR驗(yàn)證確認(rèn)重組菌包含p65亞基后，LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為mNFκBp65pEGFPC1，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。HepG2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM，隔天更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶進(jìn)行消化傳代。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞接到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到90%融合時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，首先用不含血清和雙抗的DMEM處理過(guò)夜；然后每孔按以下方法轉(zhuǎn)染，分別準(zhǔn)備50 μl optiDMEM加入0.5 μg mNFκBp65pEGFPC1重組質(zhì)粒，50 μl optiMEM 加入1 μl Lipofecta mine 2000脂質(zhì)體，靜置5 min后，將兩者充分混勻后細(xì)胞上轉(zhuǎn)染6 h；然后去除轉(zhuǎn)染液，加入無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM，恢復(fù)培養(yǎng)過(guò)夜； 利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠NFκB p65亞基擴(kuò)增

取小鼠肝臟，提取總RNA，取1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后利用PCR擴(kuò)增小鼠NFκB p65亞基開放讀碼框。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，成功擴(kuò)增了小鼠NFκB p65亞基，包含引入的酶切位點(diǎn)全長(zhǎng)1 664 bp（圖1）。

2.2 小鼠NFκB p65亞基真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述擴(kuò)增的小鼠NFκB p65亞基（通過(guò)引物引入了酶切位點(diǎn)）（圖1），以及pEGFPC1質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切（圖2），純化后用DNA連接試劑盒進(jìn)行連接。連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109進(jìn)行擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒，用PCR驗(yàn)證重組菌是否包含了目的基因（圖3）。PCR驗(yàn)證結(jié)果表明重組菌中包含了

NFκB p65亞基的開放讀碼框，然后送去測(cè)序，測(cè)序顯示重組質(zhì)粒中的插入序列與NFκB p65的ORF完全一致，說(shuō)明NFκB p65亞基的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為mNFκBp65pEGFPC1。擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒。

2.3 重組質(zhì)粒mNFκBp65pEGFPC1的真核轉(zhuǎn)染驗(yàn)證

為了驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒mNFκBp65pEGFPC1能否在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞，通過(guò)觀察綠色熒光，來(lái)判斷NFκBp65蛋白的表達(dá)情況。將不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒利用Lipofecta mine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NFκBp65后，分別在24和48 h后觀察綠色熒光（圖4）。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染48 h后有很強(qiáng)的綠色熒光，說(shuō)明重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了NFκBp65的融合蛋白。

3 討論

肥胖的流行及其相關(guān)代謝疾病，嚴(yán)重危害著人類健康。肥胖作為一種低等的慢性炎性疾病理論，已經(jīng)得到廣泛共識(shí)，也為肥胖的預(yù)防與控制提供了新的思路[4-5，12]。作為炎性調(diào)控的核心信號(hào)通路，NFκB信號(hào)通路參與了肥胖的發(fā)生及其相關(guān)代謝疾病的產(chǎn)生[6-8]。NFκB轉(zhuǎn)錄因子家族由眾多蛋白組成，其中p65亞基及其與p50組成的異源二聚體是細(xì)胞中含量最豐富的NFκB轉(zhuǎn)錄因子。因此，研究NFκB信號(hào)通路在脂肪組織炎性中的作用，并篩選以p65等NFκB轉(zhuǎn)錄因子為靶標(biāo)的天然產(chǎn)物或藥物，有助于肥胖機(jī)理的闡明和新的治療方式的開發(fā)。這就需要建立相關(guān)的體外篩選體系，那首要目標(biāo)就是建立p65的真核表達(dá)質(zhì)粒，該研究恰是圍繞這一目標(biāo)展開。

P65在肝臟中表達(dá)豐度較高，筆者利用小鼠的肝臟提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后成功擴(kuò)增小鼠p65的編碼區(qū)（圖1）。將PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后（圖2）與真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPC1連接，PCR驗(yàn)證（圖3）表明，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，將其命名為mNFκBp65pEGFPC1。提取無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，觀察到綠色熒光（圖4），說(shuō)明融合蛋白得到了成功表達(dá)。成功構(gòu)建的小鼠p65真核表達(dá)質(zhì)粒，可以用于真核表達(dá)試驗(yàn)，為后續(xù)研究NFκB信號(hào)通路在脂肪組織炎性中的作用，篩選以p65為靶標(biāo)最終調(diào)控脂肪組織炎性及相關(guān)代謝疾病的天然產(chǎn)物或藥物奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]JAMES P T， LEACH R， KALAMARA E，et al. The worldwide obesity epidemic [J]. Obes Res， 2001， 9（suppl4）： 228-233.

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