基于重組工程法高轉化效率的大腸桿菌BL21DE3表達菌株構建

張飛飛　石牡丹　尚廣東

摘要 [目的]提高最常用的異源蛋白表達宿主菌E. coli BL21（DE3）的轉化效率。[方法]利用基于質粒的重組工程系統(tǒng)和雙鏈斷裂修復功能。[結果]敲除了編碼降解外源DNA的I型限制性內切酶的hsdR基因，獲得了高轉化效率以及其他功能與BL21（DE3）仍保持一致的LS1928菌株。[結論]獲得的LS1928菌株可能會作為獲得催化用酶的關鍵材料，進而在蛋白質工程等研究領域有著重要的作用。

關鍵詞 重組工程；基因敲除；雙鏈斷裂修復；大腸桿菌BL21（DE3）

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-029-03

Abstract [Objective] The aim was to improve the conversion efficiency of the most commonly used heterologous protein expression host strain. [Method] Type I restriction endonuclease capable of degrading exogenous DNA coding gene hsdR was knocked out via plasmidbased recombineering system as well as its inherent double strand break repair（DSBR） function. [Result]The obtained strain LS1928 was still consistent with E. coli BL21（DE3） in every aspect except higher conversion efficiency.[Conclusion] The newly developed strain has the potential to be used as key material to obtain catalytic enzyme and hence plays an important role in protein engineering.

Key words Recombineering； Gene knock out； DSBR； E. coli BL21（DE3）

酶是工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵材料，也是現(xiàn)代綠色經(jīng)濟和工業(yè)生物技術的基礎。野生型的酶常常難以具有人們所期望的最佳活性。高催化活性以及高催化專一性酶的獲得常常依賴于基因突變，由于突變的隨機性，目標突變只占最終突變的極小比例，一般在百萬分之一的級別，因此高轉化效率的菌株是獲得高覆蓋率蛋白突變體庫的基礎之一。突變體庫也是研究基因或蛋白結構和功能的關鍵手段。

常規(guī)的得到蛋白突變體的試驗步驟是將通過特定方法（如DNA shuffling[1]和易錯PCR[2]）所獲得的突變體基因庫以限制性內切酶進行酶切后所得的DNA片段和同樣酶切的載體在T4連接酶的作用下相連，連接液轉化至克隆宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli）如DH10B或JM109，培養(yǎng)所得抗性菌株，從中提取質粒后，再轉化至異源蛋白表達宿主菌。其中E.coli BL21（DE3）是最為常用的宿主菌，其他菌株一般為此菌株的衍生菌株。采用提取質粒再轉化BL21（DE3）的兩步法而非直接轉化BL21（DE3）的原因在于后者的轉化效率較低，一般低10倍以上。低效率使得獲得目的突變的幾率大大降低而不被采用。兩步轉化法不僅增加了試驗步驟，且造成了一定量的（也可能是非常關鍵的）突變體庫的損失。

重組工程的基本原理是利用重組酶催化同源片段之間發(fā)生重組，而進行DNA克隆和修飾的基因工程技術[3-4]。由于可以直接采用PCR擴增的中間含有抗性基因的線性同源片段（而無需將片段克隆至載體）進行轉化，因此重組工程方法高效、簡便和快捷。該研究所使用的重組酶基因是目前所廣泛使用的，來源于λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)，包括exo、bet和gam基因。Exo蛋白[5]是一種5′-3′DNA外切酶，結合在雙鏈DNA的末端得到3′端突出的DNA分子；Bet蛋白[6]結合在突出的單鏈DNA分子上防止單鏈DNA被宿主單鏈核酸酶降解，同時還具有介導互補單鏈DNA退火；Gam蛋白[7]可與RecBCD結合抑制其降解DNA的活性。

BL21（DE3）基因組上hsdR基因編碼I型限制性內切酶，在大腸桿菌細胞中起到一種“抗體”的作用，對外來的DNA有嚴格的限制。hsdR基因的變異或缺失會導致菌株細胞內的I型限制性內切酶活性缺失，這對外來基因的導入及質粒轉化是有利的[8]。筆者通過利用重組工程的方法將E.coli BL21（DE3）菌株中的hsdR基因敲除，獲得高轉化效率的重組工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒。

E.coli DH10B、BL21（DE3）、MG1655、BW25141為江蘇省麻醉學重點實驗室保存的菌株。pET30a（+）和pBluescript II KS（-）為江蘇省麻醉學重點實驗室保存的質粒，pTKRed由美國Princeton大學Thomas Kuhlman教授惠贈。

1.1.2 試劑和儀器。

限制性內切酶、T4連接酶、IPTG、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及DNA分子量標準購自大連寶生物公司；PCR引物、蛋白質分子量標準、40%丙烯酰胺溶液、抗生素、L阿拉伯糖等購自上海生工公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR儀為BioRad公司的S1000，電轉化儀為BioRad公司的Gene PulserII。

1.1.3 DNA測序。

由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分子生物學常規(guī)操作。

大腸桿菌的培養(yǎng)、PCR擴增、質粒提取和酶切鑒定以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）等試驗按手冊[9]進行。表達重組酶的電轉化感受態(tài)的制備、DNA的電轉化以及篩選等步驟均采用文獻[10]的方法。 研究所使用的引物為：

1.2.2 質粒的構建。

1.2.2.1 卡那霉素兩側為ISceI酶切位點，R6K復制子質粒的構建。

以pKD4為模板，分別以R1115R1102和R1103R1116為引物，擴增得到0.3和0.6 kb片段，然后分別以ClaIPstI 和PstIXbaI酶切，通過三片段連接法克隆到pBluescript II KS（-）的ClaIXbaI位點上。經(jīng)酶切和測序正確后，0.9 kb的ClaIXbaI酶切片段克隆到pKD4的相同位點得到pLS1662。pLS1662使用R6K復制子，以含有Pir基因的BW25141為宿主菌，這樣以之為模板所擴增的片段轉化到常規(guī)的大腸桿菌如MG1655就不會有質粒背景的干擾。

1.2.2.2 大腸桿菌醛酸酶yidS表達載體的構建。

以MG1655 基因組DNA為模板，AL1AL2擴增的0.9 kb醛縮酶yidS基因BamHIHindIII酶切后克隆至pET30a（+）/BamHIHindIII獲得pLS182，酶切和測序正確。

1.2.3 基因敲除。

根據(jù)Kolisnychenko等的報道[10]，綜合運用重組工程和DSBR法進行基因敲除的基本步驟如下：首先將hsdR基因上下游各500 bp的同源片段以及兩側含有18 bp ISceI酶切位點的卡那霉素抗性基因通過重疊延伸PCR融合在一起，此線性融合片段還包含下游500 bp同源片段之后的50 bp的序列。將此線性融合片段電轉化至表達重組酶的BL21（DE3），由重組酶催化同源片段之間的同源重組而將線性融合片段取代BL21（DE3）基因組上的hsdR基因部分，hsdR基因被敲除。隨后經(jīng)誘導表達的ISceI作用于所得菌株基因組中的ISceI酶切位點，引起基因組雙鏈的斷裂。此時菌株利用自身的同源重組系統(tǒng)如recA和recBCD催化線性整合片段和500 bp的同源片段下游的2個50 bp片段之間發(fā)生同源重組，即將2個片段之間的序列以及其中的1個片段去除，經(jīng)過此步驟，修復了基因組雙鏈的斷裂，菌株恢復生長，最終得到hsdR基因敲除，且不含有任何的外源堿基序列的基因工程菌株，具體流程如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 BL21（DE3）菌株基因組中hsdR基因的敲除

以BL21（DE3）的基因組DNA為模板，分別以R1737和R1738以及R1741和R1742為引物，PCR擴增得到hsdR基因開放閱讀框上下游的各500 bp片段；以pLS1662為模板，R1739和R1740為引物，PCR擴增得到1.1 kb的卡那霉素抗性基因。純化3個PCR產(chǎn)物，合并作為模板，以R1738R1741為引物 PCR擴增得到2.1 kb的融合片段。將此2.1 kb片段電轉化至由IPTG誘導表達重組酶的BL21（DE3）/pTKRed電轉化感受態(tài)細胞，重組酶催化2.1 kb中的2個500 bp片段和基因組中的同源片段進行同源重組，在大觀霉素-卡那霉素雙抗的篩選作用下，所得的單菌落以R1743和R1744進行菌落PCR來驗證抗性變株的基因型，結果如圖2所示，獲得了與預期大小一致的2.5 kb，表明得到了hsdR基因被兩側含有ISceI作用位點的卡那霉素抗性基因所取代的菌株LS1926，其基因型為BL21（DE3）ΔhsdR∷SneoS，pTKRed。

將LS1926在含100 μg/ml大觀霉素的LB培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)，加入1.5% L阿拉伯糖誘導20 h。將培養(yǎng)液稀釋106后涂布LB平板，隨機挑選150個克隆影印至LB平板和含25 μg/ml卡那霉素的LB平板，所有克隆均表現(xiàn)為卡那霉素敏感性。隨機挑取單菌落，以R1743和R1744進行菌落PCR，得到0.8 kb的目的條帶（圖2）。純化該片段，以R1743和R1744為引物進行測序，發(fā)現(xiàn)與預期完全一致，即卡那霉素抗性基因以及兩側ISceI作用位點1個一段50 bp同源片段得以去除，表明獲得了hsdR基因敲除的、無任何冗余片段的變株LS1927，其基因型為BL21（DE3）ΔhsdR，pTKRed。

隨后進行pTKRed的消除試驗。將所得菌株在無抗LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)過夜后，稀釋106后涂布LB平板，隨后置于42 ℃培養(yǎng)箱進行高溫處理。隨機挑取25個克隆進行抗性驗證，發(fā)現(xiàn)其中20個均失去了大觀霉素抗性，表明pTKRed得以消除，將此菌株命名為LS1928，其基因型為BL21（DE3）ΔhsdR。

2.2 BL21（DE3）和LS1928電轉化效率的比較

為驗證BL21（DE3）及其hsdR基因敲除變株LS1928的電轉化效率，分別將50 ng的pLS182質粒DNA轉化這2個菌株，在含30 μg/ml卡那霉素的LB固體平板上進行篩選，計算總的抗性菌落數(shù)。以1 μg的質粒DNA來計算轉化效率，即轉化效率 = 菌落數(shù)/μg DNA。4次平行試驗發(fā)現(xiàn)，hsdR基因敲除變株LS1928的平均轉化效率為4.5×107/μg，而BL21（DE3）原株的平均轉化效率為3.1×106/μg，即變株的轉化效率提高了14.5倍。

2.3 BL21（DE3）和LS1928質粒酶切的比較

為驗證轉化質粒的正確性，自含pLS182的克隆宿主菌DH10B以及表達宿主菌BL21（DE3）及其hsdR基因敲除變株LS1928分別提取pLS182質粒進行酶切驗證。由圖3可見，不同菌株來源所提取的質粒酶切后的帶型一致，表明LS1928變株有著與原株一致的質粒擴增環(huán)境，hsdR基因敲除不產(chǎn)生影響。

2.4 BL21（DE3）和LS1928蛋白表達的比較

為驗證pLS182可在LS1928中表達，分別將pLS182轉化到BL21（DE3）和LS1928中。圖4為BL21（DE3）原株和LS1928分別表達醛縮酶的結果。由圖4可見，2個菌株中蛋白表達情形一致，表明hsdR基因敲除變株LS1928有著與原株BL21（DE3）相同的蛋白表達環(huán)境，hsdR基因敲除無影響。

綜上所述，hsdR基因敲除變株LS1928的轉化效率較BL21（DE3）提高14.5倍，而質粒酶切和蛋白表達的試驗證明LS1928的其他功能與BL21（DE3）保持一致，表明了LS1928的適用性。LS1928已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.7123。

3 討論

Red同源重組系統(tǒng)用于大腸桿菌K12系列菌株（如MG1655、DH10B等）成功的例子很多，其同源序列在30～50 bp就能夠達到較高的重組效率。有研究表明Red重組系統(tǒng)介導非K12系大腸桿菌重組時，重組效率相對較低[11-12]。

該研究所用的BL21（DE3）是大腸桿菌B系菌株，試驗起始，筆者嘗試利用基于pSC101質粒骨架，以L阿拉伯糖誘導表達重組酶的體系（如pKD46）和pSIM5熱誘導表達重組酶的體系，并分別設計50和500 bp同源臂進行同源重組，結果表明均不能在BL21（DE3）中有效的使用，最終摸索到該文報道的同時攜帶有Red重組酶基因和IsceI歸巢內切酶基因的pTKRed利用500 bp同源臂成功的將hsdR基因敲除。該質粒上的重組酶基因是由異丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）誘導的受LacI基因所調節(jié)pLac啟動子所驅動；ISceI基因是由L阿拉伯糖誘導的受araC基因所調節(jié)的pBAD啟動子所驅動。LacI基因和araC基因的調節(jié)系統(tǒng)均為嚴謹調節(jié)系統(tǒng)，即不加誘導劑時，啟動子下游的基因幾乎不表達，這就保證了重組酶表達的嚴格時空性，不會過量表達而引起異常重組。另外，BL21（DE3）基因組上不含有ISceI酶切位點，從而保證了ISceI酶切的良好專一性。

從突變株中提取的質粒酶切和蛋白表達試驗確證了菌株的高轉化效率，也證明了質粒在其中的正確復制和表達。高轉化效率突變株將減少一個試驗步驟，有利于簡便快捷地獲得突變體蛋白庫。高轉化效率的蛋白表達菌株將在蛋白質工程等研究領域有著重要的應用，如連接產(chǎn)物的轉化效率一般為質粒的1/100，此時10余倍的轉化效率將有助于獲得更多的轉化克隆，即覆蓋更多的突變體，有利于迅速地篩選得到目的突變。作為獲得高催化效率的催化用酶等工業(yè)化研究中的一個關鍵材料，高轉化效率的菌株LS1928將有著廣泛的應用空間，也可能獲得良好的經(jīng)濟效益。

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