HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿含量

李美艷 赫清雪 王愛(ài)武

摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定復(fù)方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿含量的方法。方法 色譜柱為Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-四氫呋喃（25∶8），B為0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脫；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：25 ℃。結(jié)果 烏頭堿在0.072～0.648 μg具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 5），平均回收率為99.29%，RSD=1.25%；新烏頭堿在0.062～0.648 μg具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 5），平均回收率為99.12%，RSD=0.85%；次烏頭堿在0.064～0.384 μg具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 8），平均回收率為99.57%，RSD=1.07%；苯甲酰烏頭原堿在0.056～0.672 μg具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 2），平均回收率為98.11%，RSD=0.61%；苯甲酰新烏頭原堿在0.055～0.993 μg具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），平均回收率為99.27%，RSD=1.10%；苯甲酰次烏頭原堿在0.078～0.702 μg具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 8），平均回收率為99.08%，RSD=1.38%。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為復(fù)方藤烏軟膏中烏頭類生物堿的含量測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：復(fù)方藤烏軟膏；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿；苯甲酰烏頭原堿；苯甲酰新烏頭原堿；苯甲酰次烏頭原堿；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.024

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）09-0087-04

Simultaneous Determination of 6 Aconitum Alkaloids in Compound Tengwu Ointment by HPLC LI Mei-yan1，2， HE Qing-xue1，2， WANG Ai-wu1 （1.Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the 6 aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment. Methods Chromatographic column was Aglient XDB-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， with the mobile phase A of acetonitrile- tetrahydrofuran （25∶8）， phase B was 0.1 mol/L ammonium acetate solution （0.5 mL acetic acid added to the 1000 mL） with gradient elution；the flow rate was 1 mL/min；the detection wavelength was set at 235 nm；the column temperature was 25 ℃. Results Aconitine was in the good linear range of 0.072-0.648 μg （r=0.999 5）， with the average recovery of 99.29%， RSD=1.25%. Mesaconitine was in the good linear range of 0.062-0.648 μg （r=0.999 5）， with the average recovery of 99.12%， RSD=0.85%. Hypaconitine was in the good linear range of 0.064-0.384 μg （r=0.999 8）， with the average recovery of 99.57%， RSD=1.07%. Benzoylaconine was in the good linear range of 0.056-0.672 μg （r=0.999 2）， with the average recovery of 98.11%， RSD=0.61%. Benzoylmesaconine was in the good linear range of 0.055-0.993 μg （r=0.999 9）， with the average recovery of 99.27%， RSD=1.10%. Benzoylhypaconine was in the good linear range of 0.078-0.702 μg （r=0.999 8）， with the average recovery of 99.08%， RSD=1.38%. Conclusion This method is simple， sensitive， repeatable and accurate， which can be used for determination of aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment.

Key words：compound Tengwu Ointment；aconitine；mesaconition；hypaconitine；benzoylaconine；benzoylmesaconine；benzoylhypaconine；HPLC

復(fù)方藤烏軟膏是山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨傷科專家與藥學(xué)人員遵循中醫(yī)藥理論共同研制的傳統(tǒng)中藥制劑，由雞血藤、生川烏、生草烏、自然銅等組成，具有消腫止痛、續(xù)筋接骨等功效，主要用于治療運(yùn)動(dòng)勞損、急性扭傷、挫傷、閃傷及輕度骨折引起的疼痛，臨床應(yīng)用30余年療效較好。

復(fù)方藤烏軟膏中的生川烏、生草烏含有烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等烏頭類生物堿，既是毒性成分又是有效成分[1]。我們前期對(duì)其制備工藝及皮膚安全性進(jìn)行了研究[2]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立復(fù)方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿的含量測(cè)定方法，為更好地控制其質(zhì)量、進(jìn)一步推廣和擴(kuò)大應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters 600F高效液相色譜儀（Waters2996紫外檢測(cè)器，Empowers色譜工作站），Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP2250型電子分析天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）；BSA223S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-600DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

復(fù)方藤烏軟膏樣品（批號(hào)分別為20140508、20140711、20140829），山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院制劑室制備；烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)110720-200410，純度≥98%）、新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)0799-9403，純度≥98.3%）、次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)0798-9403，純度≥98.6%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)RFS-B-110305，純度≥98%）、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)RFS-B-100713，純度≥98%）、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)RFS-B-110328，純度≥98%）均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、四氫呋喃為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈-四氫呋喃（25∶8），流動(dòng)相B為0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脫（0→35 min，17%→25%A；35→60 min，25%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min。理論板數(shù)按苯甲酰新烏頭原堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。在此色譜條件下，6種烏頭類生物堿均與其他組分能達(dá)到較好分離。色譜圖見(jiàn)圖1。

3.苯甲酰次烏頭原堿；4.新烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿

圖1 復(fù)方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.05%鹽酸-甲醇溶液定容至刻度，制成每毫升含烏頭堿0.180 mg、新烏頭堿0.180 mg、次烏頭堿0.180 mg、苯甲酰烏頭原堿0.560 mg、苯甲酰新烏頭原堿0.460 mg和苯甲酰次烏頭原堿0.195 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密量取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿儲(chǔ)備液各2.0、2、0、1.0、1.0、1.2、2.0 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入0.05%鹽酸-甲醇溶液稀釋至刻度，制成每毫升含烏頭堿36 ?g、新烏頭堿36 ?g、次烏頭堿32 ?g、苯甲酰烏頭原堿56 ?g、苯甲酰新烏頭原堿55.2 ?g和苯甲酰次烏頭原堿39 ?g的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取復(fù)方藤烏軟膏約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液30 mL，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz，溫度25 ℃）30 min，過(guò)濾，殘?jiān)卯惐?乙酸乙酯（1∶1）混合溶液洗3次，每次10 mL，合并濾液，回收溶劑，殘?jiān)?.05%鹽酸-甲醇溶液定容至2 mL，過(guò)0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取混合對(duì)照品溶液2、6、10、14、18 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積RSD分別為0.92%、1.27%、1.69%、1.71%、2.12%、2.24%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取復(fù)方藤烏軟膏，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄積分峰面積，結(jié)果供試品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為1.37%、1.56%、1.18%、0.94%、2.17%、1.89%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批復(fù)方藤烏軟膏，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。測(cè)得樣品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為1.75%、2.15%、1.77%、1.41%、1.35%、1.88%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取6份已知含量的復(fù)方藤烏軟膏，每份約5 g，精密稱定，分別精密加入一定濃度的6種烏頭類生物堿混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 含量測(cè)定

取3批復(fù)方藤烏軟膏，各約10 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

復(fù)方藤烏軟膏中，生川烏、生草烏所含的雙酯型生物堿（烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿）治療量與中毒量接近，經(jīng)加工炮制后轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿），毒性大大降低[3]。目前關(guān)于含有烏頭堿的中藥含量測(cè)定報(bào)道較多，但同時(shí)測(cè)定6種生物堿的方法少見(jiàn)。本研究對(duì)烏頭堿的提取方法、萃取溶劑和流動(dòng)相的種類及梯度洗脫條件進(jìn)行了反復(fù)考察和試驗(yàn)，建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方藤烏軟膏6種烏頭類生物堿含量的方法。

參考烏頭類生物堿含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道[4-5]，以6種烏頭類生物堿含量為指標(biāo)，考察了樣品中烏頭類生物堿的3種提取方法：①氨試液堿化，用乙醚提取后再用0.05 mol/L鹽酸萃取，最后用氨水調(diào)節(jié)pH到10， 再用乙醚萃取的堿化酸提法；②用0.05 mol/L鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，水層用氨試液調(diào)節(jié)pH到10，再用乙醚萃取的酸化堿提法；③氨試液堿化，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）超聲提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，法①干擾雜質(zhì)最少，但提取率相對(duì)低，損失較多；法②萃取過(guò)程容易乳化，提取率也較低；法③提取率最高，先將樣品堿化，使烏頭類生物堿游離出來(lái)，再用有機(jī)溶劑提取的方法干擾少，簡(jiǎn)便易行，提取效果較好。

對(duì)堿化后的萃取溶劑分別以乙醚、異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醚作為提取溶劑，回收較為容易、雜質(zhì)較以異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）為溶劑者少，但提取率低于后者，原因可能為異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液溶解范圍大于乙醚，故選擇異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液作為提取溶劑。

參考文獻(xiàn)[6-8]考察了甲醇-水-氯仿-三乙胺、乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液梯度洗脫、[乙腈-四氫呋喃（25∶8）]-[0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL）]梯度洗脫等流動(dòng)相條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水-氯仿-三乙胺體系，6種生物堿分離度不理想，出峰時(shí)間在20 min以內(nèi)。乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液體系，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿及新烏頭堿分離度較好，出峰時(shí)間在20～45 min之間，但烏頭堿與次烏頭堿峰重疊，無(wú)法分離。通過(guò)調(diào)節(jié)pH、醋酸銨濃度等方法，發(fā)現(xiàn)醋酸銨濃度對(duì)樣品分離作用不大，當(dāng)調(diào)節(jié)pH到9.5時(shí)，6種生物堿達(dá)到基線分離，色譜峰對(duì)稱性良好，但是pH 9.5為強(qiáng)堿性，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)填料色譜柱損傷較大。最終選擇[乙腈-四氫呋喃（25∶8）]-[0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL）]梯度洗脫。

總之，本研究在提取溶劑、萃取方法及流動(dòng)相等反復(fù)優(yōu)選的基礎(chǔ)上，成功建立了HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方藤烏軟膏6種烏頭類生物堿含量的方法，操作簡(jiǎn)便可行、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，不僅可作為復(fù)方藤烏軟膏的含量測(cè)定方法，也為含烏頭堿類其他相關(guān)制劑的含量測(cè)定提供了借鑒。

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（收稿日期：2015-02-06）

（修回日期：2015-03-03；編輯：陳靜）