脾氣虛證大鼠腦腸肽動態(tài)變化及四君子湯干預(yù)效應(yīng)研究

田茸等

摘要：目的 探討四君子湯對脾氣虛證的動態(tài)干預(yù)效應(yīng)及作用機(jī)制。方法 實驗大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、四君子湯組。除正常組外均以苦寒破氣、游泳力竭雙因素法復(fù)制脾氣虛證模型，造模同時四君子湯組給予四君子湯20 g/（kg·d）干預(yù)，采用ELISA和放射免疫法檢測不同時間點（14、21、28 d）模型大鼠小腸組織及血清中胃泌素（GAS）、胃動素（MTL）、生長抑素（SS）、血管活性腸肽（VIP）的活性，以及四君子湯的干預(yù)效應(yīng)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血清和小腸組織中GAS和MTL降低、SS和VIP升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，四君子湯組大鼠血清和小腸組織中GAS和MTL升高、SS和VIP降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 腦腸肽在脾氣虛證大鼠小腸組織和血清中呈現(xiàn)動態(tài)時相性一致的變化，四君子湯可能通過調(diào)節(jié)大鼠腦腸肽的活性從而發(fā)揮其治療脾氣虛證的作用。

關(guān)鍵詞：脾氣虛證；四君子湯；胃泌素；胃動素；生長抑素；血管活性腸肽；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0068-04

Study On Dynamic Changes of Ghrelin of Spleen-qi-deficiency Rats and Intervention Effects of Sijunzi Decoction TIAN Rong1， GONG Zi-han2， YANG Xiao-yi2， ZHU Li-ming2， DUAN Yong-qiang2， CHENG Ying-xia2， DU Juan2， LI Lan-zhen2， WANG Yan2 （1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；2.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract：Objective To observe the dynamic changes of ghrelin of spleen-qi-deficiency rats and the intervention effects of Sijunzi Decoction. Methods Experimental rats were randomly divided into normal control group， model group and Sijunzi Decoction group. Except for normal control group， spleen-qi-deficiency model was copied through the two-factor methods of breaking qi by bitter cold and swimming exhausted. Meanwhile， Sijunzi Decoction group was given 20 g/（kg·d） Sijunzi Decoction intervention. The activities of GAS， MTL， SS and VIP at different time points （14， 21， 28 d） in intestine and serum were detected by ELISA and RIA. At the same time the intervention effect of Sijunzi Decoction was studied. Results Compared with normal control group， GAS and MTL in intestine and serum of model rats decreased， while SS and VIP increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， GAS and MTL in intestine and serum of rats in the Sijunzi Decoction group increased， while SS and VIP decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Ghrelin in intestine and serum of spleen-qi-deficiency rats shows dynamic coincidental changes. Sijunzi Decoction can treat spleen qi deficiency by regulating the activities of rat ghrelin.

Key words：spleen qi deficiency；Sijunzi Decoction；gastrin；motilin；somatostatin；vasoactive intestinal peptide；rats

脾氣虛證證候有食少、納呆、食欲減退、泄瀉或便秘等消化系統(tǒng)表現(xiàn)，以及神疲、精神不振、甚至記憶力減退等中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，并且兩方面臨床癥狀會先后出現(xiàn)或同時出現(xiàn)。這符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所闡述的

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81160420）；甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃（1010RJZA148）；甘肅省教育廳項目（1006-05）

“腦腸軸”理論，即腦腸軸為連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌雙向通路，一方面各種社會應(yīng)激、情緒變化等作用于高級中樞神經(jīng)，通過腸神經(jīng)系統(tǒng)影響胃腸激素的分泌，從而調(diào)控胃腸感覺和運動；另一方面，胃腸道本身接收的各種刺激亦作用于腸神經(jīng)系統(tǒng)，迷走神經(jīng)反作用于中樞，產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。因此，腦腸軸實際上是一種腦腸互動[1]。本研究通過分階段動態(tài)檢測脾氣虛證大鼠血清和小腸組織中腦腸肽的活性，旨在發(fā)現(xiàn)脾氣虛證大鼠腦腸肽的動態(tài)表達(dá)是否有一定時相性，以及腦腸肽在不同組織中的表達(dá)是否具有一定的規(guī)律性，并在此基礎(chǔ)上探討論四君子湯對脾氣虛證的動態(tài)干預(yù)效應(yīng)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性SPF級Wistar大鼠94只，6周齡，體質(zhì)量（170±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心，合格證號SCXK（甘）2011-0001。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型14 d組、模型21 d組、模型28 d組、四君子湯14 d組、四君子湯21 d組、四君子湯28 d組，分籠飼養(yǎng)。

1.2 藥物

造模中藥：大黃、枳實、厚樸（4∶2∶3）；四君子湯：人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草（3∶3∶3∶2）。飲片購自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室按中藥常規(guī)煎法進(jìn)行煎煮，濾液濃縮至折合原藥材質(zhì)量濃度2 g/mL備用。

1.3 主要試劑與儀器

胃泌素（GAS）、胃動素（MOT）、生長抑素（SS）及血管活性腸肽（VIP）ELISA試劑盒，上海源葉生物科技有限公司，批號20130601A。BL2420F生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，成都泰電子有限公司；Benchmark Plus酶聯(lián)免疫檢測儀，美國BIO-RAD公司。

1.4 造模

以苦寒破氣、游泳力竭雙因素法復(fù)制脾氣虛證模型[2]，造模大鼠給予造模中藥藥液7.5 g/（kg·d）灌胃，并每日負(fù)重游泳，以力竭為度。脾氣虛證模型復(fù)制成功評估標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3]擬定：①蜷縮扎堆1分；②瞇眼弓背1分；③食量減少1分；④體質(zhì)量減輕1分；⑤便形質(zhì)軟1分；⑥便形溏稀2分；⑦肛溫下降2分；⑧游泳耐力下降1分。結(jié)合評估標(biāo)準(zhǔn)及大鼠體重增長幅度、進(jìn)食量、游泳力竭時間、胃殘留率、小腸推進(jìn)率等定量指標(biāo)評判大鼠脾氣虛證模型。具有大便稀溏、食欲下降2項癥狀，且總積分>5分，則認(rèn)為脾虛模型造模成功。

1.5 分組及給藥

四君子湯組大鼠在造模7 d后，繼續(xù)造模的同時，給予四君子湯20 g/（kg·d）灌胃進(jìn)行干預(yù)，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)3周（其中四君子湯用藥量以臨床等效劑量為標(biāo)準(zhǔn)，實驗等效劑量按人與動物系數(shù)折算[2]，相當(dāng)于60 kg成人每日臨床用量的10倍）。正常組、模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)28 d。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 一般情況 每日觀察各組大鼠毛發(fā)顏色、日?；顒訝顩r、大便性狀，并觀察記錄大鼠體質(zhì)量、進(jìn)飼料量、游泳力竭時間。

1.6.2 胃殘留率和小腸推進(jìn)率測定 于實驗14、21、28 d末，分別在大鼠取材前給予半固體米糊10 mL/kg灌胃處理，30 min后20%烏拉坦10 mL/kg腹腔注射麻醉，開腹，結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃，用濾紙吸干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后擦干，稱凈重。胃全重與胃凈重之差即為胃內(nèi)殘留物質(zhì)量，以胃內(nèi)殘留物與所灌半固體米糊質(zhì)量的百分比為胃內(nèi)殘留率。即胃殘留率（%）=（胃全重-胃凈重）÷半固體米糊重×100%。

同時迅速取出小腸，輕輕剝離后直鋪于白紙上，測量幽門至回盲腸部全長及幽門至黑色半固體糊前沿距離。以幽門至黑色半固體糊前沿距離與幽門至回盲部全長百分比為小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率（%）=半固體糊推進(jìn)距離÷小腸全長×100%。

1.6.3 離體腸管收縮功能測定 于實驗28 d末，采用BL-2420F生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（采樣率100 Hz）測定離體腸管收縮功能。取模型28 d組1只大鼠十二指腸，截取2段2 cm環(huán)形肌條；取正常組1只大鼠十二指腸，截取1段2 cm環(huán)形肌條。將3段肌條豎直懸掛于3個充滿Kreb液的浴槽中（持續(xù)供應(yīng)95%O2和5%CO2混合氣體，37 ℃，pH 7.14），上端接肌張力換能器，下端固定在金屬鉤上，給予初始張力2 g，平衡1 h后開始在Kreb液中滴加四君子湯濃縮液，記錄十二指腸肌條張力的變化。

1.6.4 小腸組織和血清胃泌素、胃動素、生長抑素及血管活性相關(guān)腸肽測定 于實驗14、21、28 d末，分批處死大鼠，取十二指腸和血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，ELISA測定大鼠小腸GAS、MTL、SS、VIP及血清SS、VIP，放射免疫法測定大鼠血清中GAS、MTL。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，首先進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗。滿足正態(tài)性者，不同組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常組大鼠飲食、活動、大便形性狀及毛發(fā)等均無異常，體質(zhì)量穩(wěn)定增長。模型組大鼠從14 d開始逐漸出現(xiàn)活動減少，毛發(fā)枯槁，逐漸出現(xiàn)瞇眼弓背，喜扎堆，體質(zhì)量下降，進(jìn)食量減少，大便稀軟；造模21 d后部分大鼠出現(xiàn)大便稀溏，少數(shù)出現(xiàn)水樣便或肛門脫垂；造模28 d多數(shù)大鼠便質(zhì)清稀，少數(shù)出現(xiàn)便秘。各四君子湯組大鼠的一般情況均較模型組有所改善，并隨治療時間的延長，進(jìn)食量增加、活動增多，瞇眼弓背和扎堆現(xiàn)象減少，大便性狀接近正常。

2.2 四君子湯對大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、游泳力竭時間、胃殘留率、小腸推進(jìn)率的影響

脾虛證模型大鼠隨造模時間的延長，體質(zhì)量增長幅度減緩，進(jìn)食量下降，游泳力竭時間縮短，胃殘留相對增多，小腸推進(jìn)相對增強。說明大黃枳實厚樸藥液灌胃結(jié)合游泳力竭成功復(fù)制了脾虛證模型，模擬了脾虛證患者的神疲乏力、少氣懶言、倦臥多寐、胃納不香、納食減少、停食積食、大便稀溏等癥狀。經(jīng)過四君子湯治療后，體質(zhì)量增長幅度有所增加，進(jìn)食量有所增多，游泳力竭時間有所增加，以及胃殘留相對減少，小腸推進(jìn)趨于正常。說明四君子湯能從整體上改善脾虛證大鼠的一般情況，對脾虛證相應(yīng)癥狀都有很好的治療效果。結(jié)果見表1、表2。

2.3 四君子湯對脾虛證模型大鼠離體腸管收縮功能的影響

經(jīng)四君子湯干預(yù)后，脾虛證模型大鼠離體腸管的收縮從之前的不規(guī)律、幅度小、力度輕，到之后呈現(xiàn)出有規(guī)律收縮，并且收縮幅度增加，收縮力度增強，說明四君子湯具有改善腸道收縮的作用。

2.4 四君子湯對大鼠血清和小腸胃泌素、胃動素、生長抑素及血管活性腸肽的影響

與正常組比較，模型組大鼠小腸和血清中GAS和MTL明顯降低、SS和VIP明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，四君子湯組小腸組織和血清中GAS和MTL明顯升高、SS和VIP明顯降低（P<0.05， P<0.01）。結(jié)果見表3、表4。

3 討論

腦為奇恒之府，位置最上，為元神所居之地。小腸泌別清濁，大腸傳化糟粕。濁氣出，精汁藏，則臟腑得養(yǎng)，氣機(jī)調(diào)暢，神乃正常。故有學(xué)者提出“腦腸相通”假說[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為，機(jī)體通過腦-腸軸之間的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的雙向環(huán)路進(jìn)行胃腸功能的調(diào)節(jié)，即腦腸互動[5]，是由神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸道3個層次的交互調(diào)控來實現(xiàn)的。

腦腸肽是雙重分布在神經(jīng)中樞和胃腸道的一類神經(jīng)遞質(zhì)，是腦腸軸的重要組成部分，是認(rèn)知和情感中樞與神經(jīng)內(nèi)分泌、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)相聯(lián)系的雙向交通通路的分子基礎(chǔ)。其在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺、分泌、運動中起著重要作用。常見腦腸肽有GAS、MTL、VIP、SS等。目前認(rèn)為，促使胃腸平滑肌興奮腦腸肽主要有MTL、P物質(zhì)等，使其抑制的腦腸肽主要有SS、VIP等。

GAS是重要的促胃酸分泌激素，其能促進(jìn)胃黏膜生長，調(diào)節(jié)胃蠕動，協(xié)助胰腺分泌酶類，幫助肝臟分泌膽汁，并能刺激腸蠕動。有研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證小鼠胃竇黏膜、十二指腸及下丘腦組織中GAS均減少，而SS均增多[6]。

MTL主要由十二指腸遠(yuǎn)端及空腸黏膜中M細(xì)胞分泌，是一種肽類激素，主要功能是影響胃及腸道的動力，與消化間期綜合肌電密切相關(guān)，具有腸道“清道夫”的功效；還能刺激胃蛋白酶、胰液的分泌，有助于食物消化。其生理作用主要是促進(jìn)胃腸運動，提高胃腸道、膽道、Oddis括約肌的收縮力和張力。研究發(fā)現(xiàn)，MTL對胃動力的促進(jìn)作用受下丘腦調(diào)控[7]，MTL不足可導(dǎo)致腸平滑肌松弛，胃蠕動減弱，胃排空時間延長[8]，從而產(chǎn)生胃脹、早飽等不適。

SS最初是從羊和豬下丘腦提取液中分離和鑒定的一種生長激素釋放抑制激素，存在于胃黏膜D細(xì)胞中，以胃竇和胃體部分含量最高，可視為胃黏膜的一種局部防御因子，其作用機(jī)理可能是SS與其受體結(jié)合，抑制腺苷酸活化酶的活性，降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度；SS能抑制胃酸分泌，并且致肥大細(xì)胞釋放組織胺。SS能抑制多種細(xì)胞的分泌、運動、增生[9]，如其能抑制SS、MTL、GAS、VIP等釋放，降低胃排空速度，減少腸道平滑肌的收縮，對胃腸道主要起抑制作用[10]。

VIP能引起胃、膽囊平滑肌松弛，腸平滑肌收縮，抑制胃酸分泌，刺激腸道內(nèi)水和電解質(zhì)的分泌，擴(kuò)張外周血管，并在整體上促進(jìn)了胃腸動力的作用。

本實驗結(jié)果顯示，脾氣虛證模型組大鼠隨造模時間的延長，小腸組織和血清中GAS和MTL降低，SS和VIP升高，表明大黃枳實厚樸的造模，模擬了脾氣虛證時患者出現(xiàn)的納食減少、食欲不佳、消化能力差、易致停食積食等癥狀。經(jīng)過藥物干預(yù)后，小腸組織和血清中GAS和MTL升高，說明四君子湯具有縮短胃排空時間、提高胃腸平滑肌興奮性、加強胃蠕動的作用；而小腸和血清中SS和VIP降低，說明四君子湯具有協(xié)調(diào)脾氣虛證大鼠胃腸道動力及胃液分泌的功能。故提示四君子湯能夠改善患者出現(xiàn)的納食減少、食欲不佳、胃動力差、停食積食等癥狀。作為此次研究重要的檢測指標(biāo)GAS、SS、MTL、VIP，在脾虛證大鼠血清和小腸組織中的活性變化呈現(xiàn)出時相性動態(tài)的一致。

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（收稿日期：2014-12-15；編輯：華強）