赭曲霉毒素A無毒ELISA檢測(cè)

裘雪梅 朱立鑫 劉敏等

摘要[目的]研究赭曲霉毒素A毒素的替代ELISA檢測(cè)。[方法]采用噬菌體展示技術(shù)篩選赭曲霉毒素A模擬表位，得到赭曲霉毒素A（OTA）模擬表位序列為IR（V）PMV（L）XX （X為任意氨基酸），化學(xué)合成法體外合成OTA 模擬表位肽，通過化學(xué)交聯(lián)法將OTA模擬表位肽與BSA連接，做成無毒抗原，建立無毒OTA 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，同樣通過化學(xué)交聯(lián)法將OTA多肽-BSA與HRP 相聯(lián)，建立OTA無毒直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。[結(jié)果]OTA多肽-BSA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)50%抑制濃度（IC50）為5 ng/ml，OTA多肽-BSA-HRP一步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法IC50為2.5 ng/ml，二步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法IC50為2 ng/ml。[結(jié)論]OTA模擬表位多肽能用于代替OTA毒素作為檢測(cè)抗原使用，并建立無毒ELISA檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞赭曲霉毒素A；模擬表位；ELISA檢測(cè)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）31-035-03

Research of Ochratoxin A Nontoxic ELISA

QIU Xuemei， ZHU Lixin， LIU Min et al

（School of Life Science， Jiangxi Science & Technology Normal University， Nanchang， Jiangxi 330013）

Abstract [Objective] To research the ELISA detection based on Ochratoxin A（OTA）mimic epitope. [Method] Screening the OTA mimic epitope from random phage display peptide library， and chemical synthesis was used to get the OTA mimic epitope， then synthesize OTA poly peptideBSA and OTA poly peptideBSAHRP， establish the methods of indirect and indirect competive ELISA. [Result] The IC50 of OTA poly peptideBSA indirect competive ELISA is 5 ng/ml， the IC50 of OTA poly peptideBSAHRP one step direct competive ELISA is 2.5 ng/ml， the IC50 of OTA poly peptideBSAHRP two step direct competive ELISA is 2 ng/ml. [Conclusion] OTA poly peptide based on OTA mimic epitope can be used to replace OTA toxin， and can establish nontoxin ELISA.

Key words Ochratoxin A； Mimic epitope； ELISA detection

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，易蓄積于組織中[1-2]，屬于烈性的腎臟和肝臟毒素[3-5]。OTA還具有強(qiáng)的致癌、致畸和致突變性[6-7]。產(chǎn)OTA毒素的菌株廣泛存在于自然界中，在各種農(nóng)作物、食品、飼料、人類及動(dòng)物的組織和血液中均能檢測(cè)到OTA的污染，對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅[8-9]。

高效液相色譜法（HPLC）等理化分析檢測(cè)方法可以精確地進(jìn)行定性和定量分析[10-12]，由于所需設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜以及對(duì)樣品純度有較高的要求，導(dǎo)致檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要。酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）由于具有較高的靈敏度和特異性，對(duì)樣品的純度要求不高，且操作簡(jiǎn)單，特別適合大批量樣本的檢測(cè)，因而被廣泛應(yīng)用于OTA的快速檢測(cè)[13]。

由于常規(guī)的ELISA分析方法是建立在以標(biāo)記OTA或偶聯(lián)OTA為競(jìng)爭(zhēng)抗原基礎(chǔ)上的有毒檢測(cè)體系，為此，筆者在成功以噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)篩選OTA的模擬表位的基礎(chǔ)上[14-15]，體外人工合成OTA模擬表位肽，以O(shè)TA模擬表位替代毒素標(biāo)準(zhǔn)品，建立無毒ELISA檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

OTA單克隆抗體、兔二抗為江西科技師范大學(xué)食品安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室制備；赭曲霉毒素A（OTA）、匙眼貝血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumen BSA）、N[γ馬來酰亞胺丁酰氧]琥珀酰亞胺酯（GMBS）、氮羥基琥珀酸（Nhydroxysuccinimide NHS）、ε氨基己酸、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑和羊抗小鼠酶標(biāo)二抗、OTA標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma產(chǎn)品，單克隆抗體分型試劑盒為圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司產(chǎn)品，兔抗鼠IgG：HRP酶標(biāo)二抗為經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為上海生工產(chǎn)品，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。UV205紫外分光光度計(jì)，日本島津；微量移液器，芬蘭Labsystems公司；K185紫外透射反射儀、酶標(biāo)儀，芬蘭Labsystems公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1OTA模擬表位多肽的化學(xué)合成。根據(jù)OTA模擬表位多肽的氨基酸序列，采用化學(xué)合成法合成OTA模擬表位多肽。

1.2.2OTA 單克隆抗體的制備。OTA 單克隆抗體的制備采用細(xì)胞融合法，具體步驟為：第4次免疫間隔28 d后，尾靜脈注射人工抗原0.05 mg/只，3 d后，取脾細(xì)胞在50% PEG融合劑作用下與對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP2/O雜交瘤細(xì)胞融合。經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后，換HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，以O(shè)TA 人工抗原為檢測(cè)抗原，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，篩選分泌抗OTA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆 3次均為100%陽(yáng)性后，建立細(xì)胞系并凍存。并將雜交瘤細(xì)胞接種于提前接種降植烷的BALB/c 小鼠腹腔，制備腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗。最后用單克隆抗體分型試劑盒進(jìn)行分型鑒定。

1.2.3OTA多肽BSA的化學(xué)合成。

OTA多肽與BSA的連接采用多功能試劑GMBS進(jìn)行。反應(yīng)原理：將GMBS 與適量的BSA 在中性至堿性條件下使得GMBS的羰基與BSA分子側(cè)鏈中的氨基發(fā)生反應(yīng)，然后去除未反應(yīng)的GMBS。

1.2.4OTA多肽BSA。利用“1.2.3”方法中合成的OTA多肽BSA，與HRP相聯(lián)。

1.2.5OTA多肽BSA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立。

棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作濃度：OTA多肽BSA為檢測(cè)抗原，用PBS稀釋至不同稀釋度（1、2、4 μg/ml），4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入PBS稀釋的抗體（1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600，1∶51 200，1∶102 400），取陰性血清作陰性對(duì)照，PBS作空白對(duì)照。每孔100 μl，37 ℃ 1 h后洗滌4次，加入兔抗鼠IgG：HRP酶標(biāo)二抗（100 μl/孔）；37 ℃作用1 h后，洗滌4次。3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光值（A值），根據(jù)A值選擇最佳包被抗原的濃度，然后選擇A值等于1.0～1.5抗體的稀釋倍數(shù)作為工作濃度。

根據(jù)確定的最佳包被抗原和抗體工作濃度建立基于OTA模擬表位的無毒間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：檢測(cè)抗原（OTA多肽BSA）4 ℃ 包被過夜，35%脫脂牛奶封閉。加入50 μl溶于35%甲醇PBS的OTA（0，0.1，10，50，100，200，500，1000 ng/ml）和抗體50 μl，混勻。37 ℃ 1 h后，PBST洗滌4次，加入酶標(biāo)二抗（100 μl/孔）；37 ℃作用1 h后，洗滌4次。TMB顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)A值，每個(gè)濃度測(cè)定4次，取平均值。計(jì)算各濃度的結(jié)合率，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6OTA多肽BSAHRP一步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法。

棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作濃度：包被兔二抗20 μg/ml，4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入PBS稀釋的OTA多肽BSAHRP （1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000）50ul，PBS稀釋的OTA單克隆抗體（1∶1 000，1∶ 2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000）50 μl，取陰性血清作陰性對(duì)照，PBS作空白對(duì)照，37 ℃ 0.5 h后洗滌4次，加入TMB顯色10 min，2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng)，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光值（A值），根據(jù)A值選擇最佳包被抗原的濃度，然后選擇A值等于1.0左右的抗體的稀釋倍數(shù)作為工作濃度。

根據(jù)確定的最佳包被抗原和抗體工作濃度建立基于OTA模擬表位的一步法無毒直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：包被兔二抗20 μg/ml，4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，同時(shí)加入30 μl OTA 標(biāo)準(zhǔn)品（0，0.25，050，100，200，500，1000 ng/ml），30 μl OTA多肽BSAHRP，以及40 μl OTA 單克隆抗體，37 ℃ 0.5 h后洗滌4次，加入TMB顯色10 min，2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng)，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光值（A值），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7OTA多肽BSAHRP 二步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法。棋盤滴定確定最佳的包被抗原和抗體工作濃度，步驟參照“1.2.6”的方法。根據(jù)確定的最佳包被抗原和抗體工作濃度建立基于OTA模擬表位的二步法無毒直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：包被兔二抗20 μg/ml，4 ℃ 包被過夜，5%脫脂牛奶封閉后用PBST洗滌4次，加入100 μl OTA 單克隆抗體，37 ℃ 0.5 h，PBST洗滌4次，加入50 μl OTA 標(biāo)準(zhǔn)品（0， 0.5，10，20，50，100，200 ng/ml），50 μl OTA多肽BSAHRP， 37 ℃ 0.5 h后PBST洗滌4次，加入TMB顯色10 min，2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng)，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光值（A值），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1單克隆抗體的制備

經(jīng)細(xì)胞融合，篩選到一株分泌抗OTA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（8G4），經(jīng) 3次亞克隆后，全部克隆為陽(yáng)克隆。將上述細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)及凍存后復(fù)蘇，其分泌的抗體效價(jià)穩(wěn)定不變。

2.2 OTA多肽BSA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件：包被抗原（OTA多肽BSA）濃度為2 μg/ml，抗體工作濃度為1∶102 400，酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶3 000，滴定結(jié)果見表1。OTA多肽BSA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，50%抑制濃度（IC50）為5 ng/ml。

2.3OTA多肽BSAHRP一步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件：OTA抗體工作濃度為1∶16 000，OTA多肽BSAHRP工作濃度為1∶8 000，酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶3 000，結(jié)果見表2。OTA多肽BSAHRP一步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，50%抑制濃度（IC50）為2.5 ng/ml。

2.4OTA多肽BSAHRP二步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)棋盤滴定確定的最佳ELISA分析條件：OTA抗體工作濃度為1∶16 000，OTA多肽BSAHRP工作濃度為1∶8 000，酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶3 000。OTA多肽BSAHRP二步直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，50%抑制濃度（IC50）為2 ng/ml。

3討論

通過研究OTA模擬表位多肽替代OTA毒素進(jìn)行ELISA檢測(cè)，獲得體外合成OTA模擬表位多肽的ELISA檢測(cè)的理論數(shù)據(jù)，與通過載體構(gòu)建并表達(dá)OTA模擬表位多肽建立的OTA無毒ELISA檢測(cè)法進(jìn)行對(duì)比研究（通過分子生物學(xué)方法，應(yīng)用PC89噬菌粒載體，將赭曲霉毒素A的模擬表位導(dǎo)入至M13噬菌體的主要衣殼蛋白pⅧ上，并引入了腸激酶切割位點(diǎn)，通過單克隆抗體結(jié)合及DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得了在N末端高密度表達(dá)模擬表位的重組噬菌體；再以其為競(jìng)爭(zhēng)抗原，建立了新的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)ELISA方法）[16-17]，用以

研究基于OTA模擬表位的無毒ELISA檢測(cè)方法的最佳方案，為安全、有效、快速檢測(cè)食品及飼料中的OTA污染提供可靠依據(jù)，也為諸如黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1等真菌毒素的檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

在進(jìn)一步試驗(yàn)中，還將對(duì)每種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，重點(diǎn)對(duì)OTA多肽BSAHRP一步法及二步法直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)，就該試驗(yàn)而言，一步法時(shí)間短，IC50稍高，而兩步法時(shí)間比一步法多0.5 h，但I(xiàn)C50比一步法低，同時(shí)這2種方法都具有靈敏、快速檢測(cè)的特點(diǎn)。

43卷31期裘雪梅等赭曲霉毒素A無毒ELISA檢測(cè)

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