超高效液相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中6曹謝腺嘌呤的方法研究

武婷 薛園園 趙小珍

摘要[目的]建立超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）測(cè)定豆芽中6芐基腺嘌呤（6BA）的方法。[方法]豆芽樣品經(jīng)過(guò)酸化甲醇提取，高速離心沉淀分離后，采用超高效液相色譜柱WATERS ACQUITY C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，乙腈和0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫。[結(jié)果]6BA在1.0～200.0 ng/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸系數(shù)R2為0.998 4，回收率達(dá)到85.3%～93.0%，精密度達(dá)到1.39%～2.75%。[結(jié)論]該方法穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便、快速，提取效率高，重現(xiàn)性好，對(duì)豆芽樣品中6BA的檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支持，有很高的實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜-質(zhì)譜法；豆芽；6芐基腺嘌呤

中圖分類(lèi)號(hào)S03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）34-088-02

6芐基腺嘌呤（6Benzylaminopurine，6BA）是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，是使用非常廣泛的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。6BA作為植物促長(zhǎng)劑和果蔬保鮮劑的主要成分，已在國(guó)內(nèi)外進(jìn)入應(yīng)用階段。目前，6BA的應(yīng)用已經(jīng)拓展到果樹(shù)栽培和園藝等領(lǐng)域。作為植物促長(zhǎng)劑使用，6BA能提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，最終提高產(chǎn)率，常被用于促進(jìn)豆芽的生長(zhǎng)。用6BA配成不同濃度的水劑，對(duì)于農(nóng)作物可起到調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的作用，使水稻和黃瓜增產(chǎn)、增收，并使黃豆芽粗壯且無(wú)根。據(jù)報(bào)道，市場(chǎng)上豆芽中6BA添加超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重。人體攝入過(guò)量的6BA會(huì)刺激皮膚黏膜，傷害食道和胃黏膜，出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象。而相關(guān)的定量檢測(cè)方法有常規(guī)的紫外分光光度法[1]、液相色譜法[2-7]、液相色譜-質(zhì)譜法等[8-10]。其中紫外分光光度法檢出限高，不能滿(mǎn)足痕量檢測(cè)的要求，而高效液相色譜法靈敏度低、定性能力差、抗干擾能力弱，普通高效液相色譜-質(zhì)譜法雖然靈敏度較高，但是樣品分離時(shí)間較長(zhǎng)。筆者建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)豆芽中6BA的方法，分離時(shí)間大大縮短，溶劑消耗量也減小到最低用量，并且具有更高的靈敏度和分離度，對(duì)豆芽樣品中6BA的檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料供試豆芽，市購(gòu)。主要儀器：ACQUITY UPLC XEVO TQ超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)WATERS公司；PipetLite XLS移液器（Rainin Instrument），LLC a METTLER TOLEDO Company，美國(guó)；組織搗碎機(jī)（Retsch GM200），德國(guó)；高速離心機(jī)（TGL16M），湘智離心機(jī)。

主要試劑：6BA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.0%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸，均為色譜純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；酸化甲醇，每100 ml甲醇中加入乙酸50 μl，混勻；6BA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密稱(chēng)取6BA標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g 于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于1.00 mg 6BA。臨用時(shí)用甲醇稀釋至所需的濃度。

1.2色譜條件流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈，具體情況見(jiàn)表1。

色譜柱：WATERS ACQUITY C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：40 ℃。

1.3質(zhì)譜條件電離模式：ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：900 L/h；碰撞氣流速：0.17 ml/min；母離子：226.1；子離子：91.1（定量離子），148.0；錐孔電壓：35 V；碰撞能量：25 eV，20 eV。

1.4樣品預(yù)處理試樣經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎混勻后備用。取5 g樣品（精確至0.01 g）于50 ml聚丙烯離心管中，加入10 ml酸化甲醇，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)3 min，10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入50 ml容量瓶中，樣品再用20 ml酸化甲醇重復(fù)提取2次。合并上清液，用水定容至刻度，搖勻，吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾，供UPLCMS/MS分析。

1.5方法學(xué)試驗(yàn)

1.5.1線性關(guān)系。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）未添加6BA的豆芽勻漿液，準(zhǔn)確加入6BA的對(duì)照品溶液，使豆芽樣品中6BA的濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/ml，按照“1.4”方法進(jìn)行樣品處理，按照色譜、質(zhì)譜方法進(jìn)樣，記錄MRM圖，得峰面積。得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5.2檢出限與定量限。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）未添加6BA的豆芽勻漿液，準(zhǔn)確加入6BA的對(duì)照品溶液，使豆芽樣品中6BA的濃度為0.1、0.2、0.5 ng/ml，按照“1.4”方法進(jìn)行樣品處理，按照色譜、質(zhì)譜方法進(jìn)樣。記錄MRM圖中定量離子的信噪比，以3倍信噪比計(jì)算得出檢出限，10倍信噪比計(jì)算得出定量限。

1.5.3回收率和精密度測(cè)定。平行稱(chēng)取18份5 g（精確至0.01 g）未添加6BA的豆芽勻漿液，準(zhǔn)確加入100 μl 10.0、50.0、100.0 ng/ml 6BA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行6份，使豆芽樣品中6BA的添加量為0.2、1.0、2.0 μg/kg，按照“1.4”方法進(jìn)行樣品處理，按照色譜、質(zhì)譜方法進(jìn)樣，計(jì)算每個(gè)濃度下的回收率，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系選用6BA的溶液濃度為1.0～200.0 ng/ml的樣品溶液進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見(jiàn)圖1。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3 327.1x+60 386，r2=0.998 4。線性關(guān)系良好，完全符合方法學(xué)要求。6BA標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM圖見(jiàn)圖2。

2.2檢出限與定量限對(duì)豆芽樣品中6BA的濃度為0.1、0.2、0.5 ng/ml測(cè)定所得的MRM圖中的色譜峰進(jìn)行信噪比計(jì)算，濃度為0.1 ng/ml時(shí)，信噪比大于3倍空白信噪比，得出檢出限為0.1 ng/ml。濃度為0.2 ng/ml時(shí)，信噪比大于10倍空白信噪比，得出定量限為0.2 ng/ml。

2.3回收率與精密度選擇未添加6BA的豆芽作為空白樣品，選擇3個(gè)濃度的6BA進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，所得結(jié)果見(jiàn)表1。豆芽樣品中平均回收率為85.3%～93.0%。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中對(duì)檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求中，被測(cè)組分濃度含量小于0.1 mg/kg時(shí)，回收率在60%～120%，符合方法學(xué)的要求。計(jì)算每個(gè)濃度下平行6次的試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，所得精密度見(jiàn)表1。

2.4實(shí)際樣品分析采用所建立的分析方法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)抽查的綠豆芽、黃豆芽等豆芽類(lèi)樣品共10批次進(jìn)行6BA殘留量的定性、定量分析。結(jié)果表明，被測(cè)的10批次樣品中，均未檢出6BA。

3結(jié)論

該研究建立了豆芽中6BA的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法。通過(guò)線性關(guān)系、檢出限與定量限、空白基質(zhì)中3個(gè)濃度的加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)等方法學(xué)考查，得出該法結(jié)果滿(mǎn)意，完全符合方法學(xué)要求。方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，便于推廣使用，對(duì)于豆芽中6BA的殘留監(jiān)控提供了有力的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳增茹，李長(zhǎng)榮.紫外分光光度法測(cè)定6BA的含量[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，3 （3）：87-89.

[2] 趙樹(shù)蘭，韓蘊(yùn)華，喬艷紅，等.豆科植物促長(zhǎng)劑中6BA的RPLC研究[J].天津師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1998，18（1）：43-46.

[3] 謝君，張義正.植物內(nèi)源激素的反相高效液相色譜法測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2001，20（1）：60-62.

[4] 李小平，陳曉紅，姚潯平，等.HPLC法測(cè)定豆芽中6BA殘留研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（2）：149-151.