高效液相色譜法檢測雞蛋中四種激素殘留量

汪竟芝，胡琳，曹瑩瑩，程桂林，胡金玲

（池州市食品藥品檢驗中心，安徽池州247000）

高效液相色譜法檢測雞蛋中四種激素殘留量

汪竟芝，胡琳，曹瑩瑩，程桂林，胡金玲

（池州市食品藥品檢驗中心，安徽池州247000）

建立一個簡便、重現(xiàn)性好測定雞蛋中的雌二醇、雌酮、雌三醇及睪酮殘留量的方法。使用高效液相色譜法，選擇流動相為：乙腈∶甲醇∶四氫呋喃∶（0.01 mol/l）醋酸鈉=2∶2∶1∶5，能夠有效提高色譜峰的分離度，190 nm～800 nm波段下掃描，選擇270 nm為最佳吸收波長，柱溫：30℃。結果表明4種激素的方法檢出限為0.06 mg/kg～0.17 mg/kg，樣品回收率是79.23%～102.26%，相對標準偏差為1.05%～4.21%。該方法準確度高，操作簡便。

激素殘留；雞蛋；分析；高效液相色譜

甾體激素藥物在動物體內(nèi)代謝緩慢，殘留多集中在動物的內(nèi)臟組織，食用極小量激素殘留的動物性食品會造成人體代謝紊亂，導致人體各器官、系統(tǒng)的疾病甚至癌癥的高發(fā)。生活中大多數(shù)人選擇雞蛋來補充營養(yǎng)，而一些不法養(yǎng)殖戶為追求更高的經(jīng)濟效益，通過在飼料中添加各種激素類藥物來提高雞的產(chǎn)蛋量。因此雞蛋中不僅含有內(nèi)源性激素，也可能含有外源性激素。對這類雞蛋進行甾類激素殘留量的檢測是保障食品安全的一項重要工作。雌二醇、雌三醇、雌酮、睪酮是具有代表性的甾類激素，因此，參考相關文獻資料，筆者采用高效液相色譜法，摸索檢測條件，對雞蛋中激素多殘留同時進行檢測具有一定的實際意義［1-3］。

1材料與方法

1.1主要儀器及試劑

［Ultimate3000］高效液相色譜儀DAD檢測器：美國賽默飛世爾公司，色譜柱AcclaimTM120 Lot Validation -C18 5 um 120A.（4.6×150 mm）離心機：DT5-2型低速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司；渦動混合器：XW-80A旋渦混合器：上海青浦瀘西儀器廠；分析天平：XP205電子天平：瑞士梅特勒公司。乙腈、甲醇均為色譜純；醋酸鈉、四氫呋喃均為分析純；實驗用水為UP水。標準品來源：雌二醇、雌三醇、雌酮均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：100182-201205、100934-200701、100849-200501；睪酮（德國進口），批號為：10519。供試樣品：雞蛋（購自池州永輝超市）。

1.2色譜條件

流動相：乙腈∶甲醇∶四氫呋喃∶0.01 mol/L醋酸鈉=2∶2∶1∶5；流速1.0 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量10 μL；柱溫：30℃。

1.3標準溶液的配制、多點校準

4種激素的標準工作溶液見表1。

1.4樣品的制備

將新鮮雞蛋打碎后攪拌均勻，稱取樣品5.0 g（精確到0.1 g）置入50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入10.0 mL甲醇，在快速混勻器上渦動混合，震蕩20 min，再用超聲波提取20 min，于4 000 r/min離心10 min，將上清液移出，殘渣中再加10.0 mL甲醇，在快速混勻器上渦動混合，中速震蕩20 min，超聲提取20 min，于4 000 r/min離心10 min，合并上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾成待測溶液。

表1　4種激素的系列標準工作溶液Table 1A series of standard working solution of four kinds of anabolic steroids

1.5測定方法

1.5.1檢測條件的選擇

取0.018 4 mg/mL雌二醇、0.020 1 mg/mL雌三醇、0.022 1 mg/mL雌酮、0.020 5 mg/mL睪酮的混合標準溶液于190 nm～800 nm波段下掃描，最大吸收波長均在230 nm，280 nm附近，選擇270 nm作為檢測波長；選擇乙腈∶甲醇∶水（30∶20∶50）作為流動相，四種激素的出峰時間分別為：20、21.5、22.5、3.25 min，為了將四種標準品色譜峰能夠較好地分離，選擇乙腈∶甲醇∶四氫呋喃∶0.01 mol/L醋酸鈉=2∶2∶1∶5。用外標法的相對保留時間進行定性，用外標法定量。

1.5.2樣品的測定

在上述色譜條件下，保留時間分別為：雌二醇8.727 min、雌三醇2.977 min、雌酮10.180 min、睪酮7.560 min，將處理后的樣品溶液進樣10 μL，重復2次，取峰高的平均值，在標準工作曲線上查得樣品濃度。并計算各組分激素的殘留量。

2結果分析

2.1混合標準溶液色譜圖

從圖1可知，混合標準溶液在所采用的色譜條件下，目標組分得到了很好的分離。

圖1　四種激素標準工作液色譜圖Fig.1Four kinds of anabolic steroids standard working liquid chromatogram

圖2　雞蛋加標色譜圖Fig.2Chromatogram of standard sample add egg

2.2雞蛋加標色譜圖分析

將圖2雞蛋加標色譜圖與混合標準工作液色譜圖（圖1）對照可知，加標色譜圖中目標組分同樣得到很好的分離，保留時間一致，且無雜質(zhì)色譜峰的干擾。說明此實驗前處理過程對目標組分測定影響較小，滿足實驗準確度的要求。

2.3標準工作曲線與檢出限

從表2可知：4種激素的線性關系良好，R2均大于0.999，說明本方法適用于甾類激素的定量分析。

表2　4種激素的線性方程、線性范圍及相關系數(shù)Table 2The regression equations，linear ranges and correlation coefficients of four anabolic steroids

2.4準確度和精密度實驗

采用陰性雞蛋樣品（4種激素均未檢出）添加高、中、低3個濃度標準溶液，按樣品的前處理方法提取和凈化后進行的加標回收試驗，回收率79.23%～102.26%，相對標準偏差為1.05%～4.21%，驗證了此測試方法可行。計算加標回收率和RSD見表3。

表3　4種激素回收率試驗結果及RSDTable 3The results of four anabolic steroids recovery rate test，RSD

3結論

通過甲醇振蕩、超聲波提取以及優(yōu)化高效液相色譜條件，成功摸索出同時測定了雞蛋中4種激素：雌二醇、雌三醇、雌酮、睪酮殘留量的方法，該方法檢出限為0.06mg/kg～0.17mg/kg，樣品回收率是79.23%～102.26%，相對標準偏差為1.05%～4.21%。表明雜質(zhì)干擾少，重復性好，操作簡單，能夠滿足日常監(jiān)測的要求。

［1］劉文英.藥物分析［M］.北京人民衛(wèi)生出版社，2007

［2］國家藥典委員會.中國藥典2010版二部［S］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010

［3］吳啟陸，沈清.高效液相色譜同時測定雞蛋中4種激素殘留量的方法［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（5）：852，878

Determination of Four Anabolic Steroids in Eggs by High Performance Liquid Chromatographic

WANG Jing-zhi，HU Lin，CAO Ying-ying，CHENG Gui-lin，HU Jin-ling
（Chizhou Municipal Food and Drug Inspection Center，Chizhou 247000，Anhui，China）

A efficient method for analysis of estradiol，estrone，estriol，testosterone in eggs was developed.The separation was achieved with a mobile phase composed of acetate sodium（0.01mol/L）-acetonitrile-methanoltetrahydrofuran（5∶2∶2∶1）.The mixed the standard solution of four kinds of anabolic steroids in the 190 nm-800 nm bandwidth scan，selected 270 nm with optimum absorption wavelength.The column was maintained at 30℃.The limit of detection were between 0.06 mg/kg-0.17 mg/kg.Overall recoveries were between 79.23%-102.26%，relative standard deviations between 1.05%and 4.21%.The method was suitable to simultaneously analyze the four anabolic steroids in eggs with simplicity and accuracy in a single injection.

multi-residue；egg；analysis；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.026

2014-01-09

汪竟芝（1967—），女（漢），主管藥師，本科，研究方向：食品安全檢驗等工作。