雌三醇的共晶研究*

徐娟，寧麗峰

(國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所生殖健康工程技術(shù)中心，北京 100081)

近年來，共晶研究成為提高藥物溶解度和生物利用度的重要手段[1-6]。已上市的共晶藥物包括沙庫必曲-纈沙坦共晶(治療心力衰竭)和伊格列凈-L-脯氨酸共晶(治療2型糖尿病)等[7]。藥物共晶是藥物活性成分(active pharmaceutical ingredient，API)與共晶形成物(cocrystal former，CCF)通過氫鍵或其他弱相互作用結(jié)合形成的二元或多組分晶體體系。通過選擇具有不同性質(zhì)的CCF，可以在不改變API結(jié)構(gòu)的情況下，在分子水平上改進或設(shè)計其理化性質(zhì)，這對維持API在體內(nèi)的生物活性非常重要[8-13]。

雌三醇[estriol，雌甾-1，3，5(10)-三烯-3，16α，17β-三醇]是一種甾體雌激素，是雌酮和雌二醇的代謝產(chǎn)物[14]。雌三醇可用于子宮頸炎，尤適用于絕經(jīng)期綜合征、老年性陰道炎；可用于前列腺肥大、前列腺癌等[15-18]。雌三醇是無臭、無味的白色結(jié)晶性粉末，在水中不溶。雌三醇具有兩種不同的羥基(酚羥基與三級羥基)，可以作為電子受體和給體形成氫鍵，因此可以與水、醇類、酰胺、酮類、鹵代烷、二甲亞砜等形成多種溶劑合物[19]。據(jù)此推斷，形成共晶可能是提高雌三醇水溶性的可行策略。

本文以雌三醇為研究對象，采用球磨法和混懸法，共制備獲得雌三醇-脲共晶、雌三醇-乙酰胺共晶、雌三醇-哌嗪共晶、雌三醇-異煙堿共晶、雌三醇-萘共晶、雌三醇-蒽共晶、雌三醇-菲共晶等7種共晶，采用粉末X-射線衍射(powder X-ray diffraction，PXRD)分析法、熱重分析法、差示掃描量熱法、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)法、核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance spectra，1H-NMR)法等晶型結(jié)構(gòu)確證方法對共晶結(jié)構(gòu)進行表征，獲得了7種共晶的標(biāo)準(zhǔn)圖譜和數(shù)據(jù)，并進一步檢測了這些共晶的穩(wěn)定性和水溶性。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 雌三醇原料藥(華潤紫竹藥業(yè)有限公司，批號：20190601，含量：99.90%，圖1)，脲、乙酰胺、哌嗪、異煙堿、萘、蒽、菲(上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司，含量均>99%，圖2)。實驗中使用的其他溶劑均為分析純。

圖1 雌三醇結(jié)構(gòu)圖 Fig.1 Structure of estriol

圖2 7種共晶形成物結(jié)構(gòu)圖 Fig.2 Structures of seven cocrystal formesrs

1.2雌三醇共晶的制備 球磨法：以乙酸乙酯為助溶劑，將雌三醇和共晶配體以1：1摩爾比，使用球磨儀(德國Retsch MM200)在25 Hz球磨30 min，得到白色固體粉末?；鞈曳ǎ阂砸宜嵋阴榛鞈胰軇?，將雌三醇和共晶配體以1：1摩爾比，于室溫攪拌反應(yīng)24 h。過濾，收集白色固體濾渣，濾液于室溫揮發(fā)溶劑得到無色塊狀晶體。

1.3儀器及分析方法 PXRD：Bruker D8 PHASER，德國布魯克分析有限公司。測試條件：常溫，光源Cu Ka(1.5418 ?)，電壓30 kV，電流10 mA，測試步長0.014°，掃描速度0.1 s/step，掃描范圍3～60°(2θ)。

FTIR：Bruker Vertex 70，德國布魯克分析有限公司。測試條件：掃描范圍4000～650 cm-1，分辨率4.000 cm-1，掃描次數(shù)128次，衰減全反射技術(shù)測定。

同步熱分析(thermo gravimetric-differential scanning calorimetry，TG-DSC)：STA 449F3+ASC，德國耐馳儀器制造有限公司。分析條件：鋁坩堝，氮氣氛圍(保護氣20 mL·min-1，吹掃氣60 mL·min-1)，溫度范圍為室溫～400 ℃，升溫速率10 ℃·min-1。

'H-NMR：AVANCE Ⅲ 400MHz，德國布魯克分析有限公司。測試條件：溶劑d6-DMSO，掃描16次。

穩(wěn)定性評價：使用藥品穩(wěn)定性實驗箱(DAA-1型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。測試條件：將樣品分別在高溫(60 ℃)、高濕[(90±5)%]、光照[(4500±500) lx]條件下，于藥品穩(wěn)定性實驗箱中放置10 d，取樣進行PXRD分析。

水溶性研究：使用溶出儀(RC806D，天津天大天發(fā)科技有限公司)。實驗條件：去離子水(脫氣備用)，體積：1000 mL，溫度：37 ℃，轉(zhuǎn)速：100 r·min-1，取雌三醇不同共晶研細，分別取細粉20 mg，置溶出儀中，于5，15，30，60，120，240，300和360 min取樣10 mL，并補液10 mL，經(jīng)孔徑0.45 μm膜濾過，利用高效液相色譜法測定含量。

2 結(jié)果

2.1PXRD 雌三醇7種共晶的PXRD圖譜見圖3。分析結(jié)果表明雌三醇7種共晶在衍射峰數(shù)量、衍射峰位置、衍射峰強度、衍射峰幾何拓撲等特征方面存在差異(表1)。蒽和菲是同分異構(gòu)體，它們與雌三醇形成的共晶在圖譜上有一定相似度。

表1 雌三醇及7種共晶形成物的PXRD特征峰 Tab.1 PXRD characteristic peaks of estriol and seven cocrystal formers

圖3 雌三醇及7種共晶形成物的PXRD圖譜 Fig.3 PXRD patterns of estriol and seven cocrystal formers

2.2TG-DSC 雌三醇7種共晶的TG-DSC圖譜和實驗數(shù)據(jù)見圖4和表2、表3。由 TG 圖譜可以看出，除雌三醇-乙酰胺共晶外，其他6種雌三醇共晶均存在明顯的失重臺階；7種共晶的 DSC 曲線存在明顯差異，表現(xiàn)在吸熱峰位置、數(shù)量、焓值等。

表2 雌三醇及7種共晶形成物的TG 數(shù)據(jù) Tab.2 TG results of estriol and seven cocrystal formers

表3 雌三醇及7種共晶形成物的DSC數(shù)據(jù) Tab.3 DSC results of estriol and seven cocrystal formers

圖4 雌三醇及7種共晶形成物的TG-DSC 圖譜 Fig.4 TG-DSC curves of estriol and seven corystal formers

2.3FTIR 雌三醇7種共晶的FTIR圖譜和實驗數(shù)據(jù)分別見圖5和表4。通過分析可知：7種共晶的FTIR圖譜既具有一定的相似性，又存在明顯差異，表現(xiàn)在吸收峰位置、吸收峰數(shù)量、吸收峰強度等。例如萘、蒽、菲均為稠環(huán)化合物，三者與雌三醇形成的共晶具有相近的FTIR圖譜。異煙堿、乙酰胺和脲都含有伯酰胺基，3500～3100 cm-1區(qū)域存在N-H伸縮峰，1680～1630 cm-1區(qū)域存在C=O伸縮峰。

表4 雌三醇及7種共晶形成物的FTIR數(shù)據(jù) Tab.4 FTIR results of estriol and seven cocrystal formers

圖5 雌三醇及7種共晶形成物的FTIR 圖譜 Fig.5 FTIR curves of estriol and seven cocrystal formers

2.41H-NMR 雌三醇7種共晶的1H-NMR圖譜和實驗數(shù)據(jù)分別見表5和圖6。液態(tài)核磁共振氫譜是確定共晶分子間計量比最直觀且有效的方法。比較雌三醇與7種共晶的1H-NMR可知，共晶氫譜中的氫峰是雌三醇與共晶試劑氫峰的疊加，7種共晶的API與CCF的摩爾劑量比均為 1：1。

圖6 雌三醇及7種共晶形成物的1H-NMR 圖譜 Fig.6 1H-NMR spectra of estriol and seven cocrystal formers

表5 雌三醇及7種共晶形成物的1H-NMR數(shù)據(jù) Tab.5 1H-NMR results of estriol and seven cocrystal formers

2.5穩(wěn)定性 通過穩(wěn)定性實驗考察樣品在高溫、高濕、光照條件下的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)變規(guī)律。雌三醇7種共晶的穩(wěn)定性實驗PXRD圖譜見圖7，實驗結(jié)果表明，7種共晶在高溫、高濕、光照條件下穩(wěn)定。

圖7 穩(wěn)定性實驗中雌三醇7種共晶形成物的PXRD圖譜 Fig.7 PXRD patterns of seven cocrystal formers of estriol in stability evaluation test

2.6水溶性 雌三醇7種共晶在水中的溶解性實驗結(jié)果(圖8)表明，7種共晶表現(xiàn)出不同的溶解性質(zhì)，且水溶性均大于雌三醇，通過形成共晶可以提高雌三醇的水溶性。其中，雌三醇-萘共晶在溶解過程中存在彈簧效應(yīng)和降落傘效應(yīng)，即在溶解過程中雌三醇-萘共晶的溶液濃度先到達一個過飽和的較高值，再析出固體降低濃度，延長亞穩(wěn)區(qū)域、減緩濃度下降過程，使體系能在高濃度維持較長時間；雌三醇-乙酰胺共晶和雌三醇-蒽共晶在水溶性實驗觀察時間內(nèi)出現(xiàn)彈簧效應(yīng)。

圖8 雌三醇及其7種共晶形成物在水中的溶解曲線 Fig.8 Solubility curves of estriol and seven cocrystal formers in water

3 討論

藥物的理化性質(zhì)是影響其在臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵因素之一，對藥物理化性質(zhì)的改善研究一直是研究人員關(guān)注重點，藥物共晶是目前改善原料藥物化性能的新方法和手段。雌三醇是甾體激素類藥物，水溶性差。本文選用雌三醇作為活性分子，通過與不同配體結(jié)合，采用球磨法和混懸法得到雌三醇-脲共晶、雌三醇-乙酰胺共晶、雌三醇-哌嗪共晶、雌三醇-異煙堿共晶、雌三醇-萘共晶、雌三醇-蒽共晶、雌三醇-菲共晶等7種共晶，對得到的共晶結(jié)構(gòu)分別采用PXRD、TG-DSC、FTIR、1H-NMR等晶型結(jié)構(gòu)鑒定分析，提供了不同分析方法的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，并對共晶進行了穩(wěn)定性評價和水溶性測試，實驗證明上述7種共晶具有良好的穩(wěn)定性和優(yōu)于雌三醇的水溶性。

蒽和菲是同分異構(gòu)體，它們與雌三醇形成的共晶在PXRD圖譜上有一定相似度，表現(xiàn)在衍射峰的位置和強度等。7種共晶的同步熱分析圖譜存在明顯差異，表現(xiàn)在失重臺階及吸熱峰位置、數(shù)量、焓值等。萘、蒽、菲均為稠環(huán)化合物，三者與雌三醇形成的共晶具有相近的FTIR圖譜。異煙堿、乙酰胺和脲都含有伯酰胺基，3500～3100 cm-1區(qū)域存在N-H伸縮峰，1680～1630 cm-1區(qū)域存在C=O伸縮峰。1H-NMR圖譜表明，7種共晶的API與CCF的摩爾計量比均為 1：1。

雌三醇在臨床上應(yīng)用比較廣泛，通過對雌三醇的共晶進行研究，為其共晶藥物的選擇和深入臨床研發(fā)提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。7種CCF中，脲是《中華人民共和國藥典》收錄的藥用輔料，因此雌三醇-脲共晶符合成藥性要求，進一步的研究正在進行中。