• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)研究

    2015-10-21 10:58:43王嵐劉新張帆肖純凌
    關(guān)鍵詞:歧化酶超氧化物醫(yī)學(xué)院

    王嵐,劉新,張帆,肖純凌

    (1.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽(yáng) 110034;2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室;3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2011級(jí)2班)

    重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)研究

    王嵐1,2,劉新1,2,張帆3,肖純凌1*

    (1.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽(yáng) 110034;2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室;3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2011級(jí)2班)

    目的:構(gòu)建人銅鋅超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá),純化及鑒定目的蛋白,為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法:根據(jù)已報(bào)道的hCu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技術(shù)從外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中獲得SOD cDNA序列。將所得的PCR產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體pET22b(+)中,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定正確后,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta(DE3),通過(guò)異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白,經(jīng)鎳固定金屬親和層析純化。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD生物學(xué)活性。結(jié)果:序列分析表明SOD基因成熟肽編碼區(qū)含有465 bp與GenBank(X02317)中已報(bào)道序列一致的SOD核苷酸。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析顯示表達(dá)的目的蛋白分子量約為19 kD,免疫印跡分析顯示其與商品化的His-tag抗體呈特異性反應(yīng),但主要以包涵體形式表達(dá),可溶性蛋白表達(dá)量很少。經(jīng)Ni2+-NTA瓊脂糖純化獲得SDSPAGE電泳下單一條帶??扇艿鞍酌富盍?60 U/ml(SOD的酶比活力為630 U/mg)。結(jié)論:在大腸桿菌中獲得了人源SOD的高效表達(dá),為研究其生物學(xué)功能及廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    超氧化物歧化酶;大腸桿菌;表達(dá)

    超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是體內(nèi)抗氧化物酶系的主要成員之一,廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物以及一些微生物體內(nèi),由蛋白質(zhì)和金屬離子組成。1938年Mann等[1]首次從牛紅細(xì)胞中得到一種含銅蛋白-血銅蛋白,1969年MeCord等[2]發(fā)現(xiàn)此蛋白能夠使超氧陰離子自由基O2-發(fā)生歧化反應(yīng),證實(shí)其具有清除生物體內(nèi)氧自由基的特異性生物活性,因而將其定名為SOD并受到廣泛重視,已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。因此,本研究擬將人源SOD基因克隆并表達(dá)于大腸桿菌中,以提高其表達(dá)量,不僅有著重要的理論意義,而且具有重要的實(shí)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與試劑 大腸桿菌E.coli DH5a菌株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供,Rosseta(DE3)感受態(tài)菌株購(gòu)自北京康為世紀(jì)科技有限公司;原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)由沈陽(yáng)化工學(xué)院研究所提供;限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I,Hind III及T4 DNA連接酶(美國(guó)Promega公司);Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司);鎳離子親和層析柱(英國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司);質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(日本Takara公司);SOD活性測(cè)定試劑盒(黃嘌呤氧化酶法)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

    1.2 寡核苷酸引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank(X02317)的hCu,Zn-SOD的cDNA序列,設(shè)計(jì)編碼該基因片段的5′和3′端寡核苷酸引物,引物序列P1:5′-CGGAATTC TTGGGCGATCCCAATTAC-3′(劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn))。委托大連寶生物工程公司合成。

    1.3 RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序 Trizol試劑從經(jīng)IL-2刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA,RT-PCR得到hCu,Zn-SOD基因雙鏈DNA,PCR參數(shù):98℃5 min;98℃30 s,59℃30 s,72℃15 s,循環(huán)次數(shù)30次;72℃5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產(chǎn)物,將純化后PCR產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體pET22b(+),構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET22b-SOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5a,經(jīng)過(guò)抗性篩選、酶切鑒定、PCR鑒定,初篩陽(yáng)性克隆菌株。委托大連寶生物工程公司測(cè)序。

    1.4 表達(dá)菌株的構(gòu)建 提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET22b-SOD,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Rosseta(DE3),抗性篩選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒酶切鑒定。

    1.5 pET22b-SOD的誘導(dǎo)表達(dá) 挑選4個(gè)重組菌單菌落分別接種于2 ml LB液體培養(yǎng)基37℃,160 r/min振搖過(guò)夜,次日以1∶100接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中37℃,230 r/min異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)培養(yǎng)至吸光度600值為0.6,加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG,0.1 mmol/L ZnSO4,0.1 mmol/L CuSO4,于37℃ GCCACCATGGCGACGAAGGCCGTG-3′(劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn));P2:5′-CCAAGCTT誘導(dǎo)表達(dá)4 h,4℃12 000 r/min IPTG離心15 min收集菌體,溶于1 ml PBS中,用超聲儀300 W超聲1 h,13 000 r/min離心15 min,取上清,沉淀加入10倍體積8 mol/L尿素溶解,各取30 μl進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析。

    1.6 可溶性SOD表達(dá)條件優(yōu)化 對(duì)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET22b-SOD的DE3菌株進(jìn)行小誘條件摸索,特別是不同誘導(dǎo)溫度(37℃、20℃)及不同誘導(dǎo)時(shí)間,用SDS-PAGE分析結(jié)果。

    1.7 Western blotting分析 將上述37℃對(duì)照組和處理組裂解上清及沉淀,同時(shí)將20℃過(guò)夜誘導(dǎo)對(duì)照組和處理組樣品裂解上清及沉淀,各取20 μl進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證。

    1.8 目的蛋白純化和復(fù)性 按照上述最佳誘導(dǎo)條件培養(yǎng)50 ml工程菌后,超聲破碎收集上清液(400 W,破5 s,停5 s,反復(fù)30個(gè)循環(huán)),4℃12 000 r/min離心20 min后獲得蛋白的包涵體。將蛋白包涵體用變性裂解緩沖液重懸,鎳凝膠親和層析純化目的蛋白,洗脫的蛋白采用氧化型/還原型谷胱甘肽體系進(jìn)行復(fù)性。

    1.9 表達(dá)產(chǎn)物生物活性測(cè)定 收集復(fù)性、濃縮后的目的蛋白溶液,測(cè)定總體積并使用BCA蛋白測(cè)試試劑盒測(cè)定蛋白含量。利用SOD活性測(cè)定試劑盒(黃嘌呤氧化酶法)測(cè)定重組蛋白的生物學(xué)活性。

    2 結(jié)果

    2.1 hCu,Zn-SOD基因的克隆及測(cè)序結(jié)果 RTPCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,在約465 bp處有與預(yù)期大小一致的DNA條帶,測(cè)序結(jié)果(DNA序列測(cè)序號(hào)ccs2370)與GenBank(X02317)報(bào)道一致,見(jiàn)圖2。

    圖1 SOD的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

    圖2 重組質(zhì)粒pET22b-SOD中SOD基因的測(cè)序結(jié)果比對(duì)

    2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行PCR并經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后均產(chǎn)生預(yù)期大小的目的片段,見(jiàn)圖3、4。

    圖3 pET22b-SOD菌落PCR結(jié)果

    2.3 重組蛋白的表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosseta(DE3)后,小誘條件摸索:結(jié)果表明SOD在無(wú)誘導(dǎo)情況下即可表達(dá),且主要以包涵體形式(沉淀)存在,見(jiàn)圖5。

    為驗(yàn)證目的蛋白是否表達(dá),并提高可溶性蛋白的表達(dá)量。將上述37℃對(duì)照組和處理組裂解上清及沉淀,同時(shí)將誘導(dǎo)溫度降至20℃,過(guò)夜誘導(dǎo)對(duì)照組和處理組樣品裂解上清及沉淀,各取20 μl進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證,結(jié)果表明pET22b-SOD最佳表達(dá)條件為:0.1 mmol/L IPTG,0.1 mmol/L ZnSO4,0.1 Mmol/L CuSO4,20℃過(guò)夜誘導(dǎo),可溶性蛋白表達(dá)量較37℃有所提高,見(jiàn)圖6。

    圖5 pET22b-SOD 37℃誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

    圖6 Western blotting檢測(cè)不同溫度誘導(dǎo)下SOD的表達(dá)

    2.4 鎳凝膠純化目的蛋白 經(jīng)超聲破碎離心后獲得的包涵體用變性裂解緩沖液重懸,使包涵體變性可溶。包涵體溶解后的上清液,用鎳親和層析柱純化,將上清液過(guò)濾后,與親和層析介質(zhì)充分結(jié)合,宿主菌Rosseta(DE3)多數(shù)雜蛋白因不與Ni2+結(jié)合用1×Binding Buffer沖洗時(shí)直接從柱中流出,再分別以含20 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L咪唑的Eluting Buffer洗脫其余雜蛋白,重組蛋白由于具有His-tag,與Ni2+-螯合親合柱的結(jié)合力最強(qiáng),在咪唑濃度達(dá)到500 mmol/L時(shí)被洗脫,見(jiàn)圖7。

    圖7 SDS-PAGE分析親和層析純化SOD表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)果

    2.5 表達(dá)蛋白SOD含量及生物活性測(cè)定 將經(jīng)親和層析純化后的重組蛋白液收集到透析袋中,浸入6 mol/L尿素復(fù)性液中,同時(shí)加入還原/氧化型谷胱甘肽(reduced/oxidized glutathione,GSH/ GSSG),經(jīng)過(guò)逐步降低尿素濃度,最后用PBS透析得到含有生物活性的目的蛋白。BCA蛋白測(cè)試試劑盒測(cè)定純化蛋白含量為0.73 mg/ml,經(jīng)SOD檢測(cè)試劑盒利用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定可溶性蛋白酶的活性,得出可溶蛋白酶活力達(dá)460 U/ml(SOD的酶比活為630 U/mg)。

    3 討論

    近幾十年,SOD一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn),其研究大多集中于從動(dòng)物血液或臟器中提取SOD,由于含有各種難以消除的病毒及外源污染,歐盟已于1999年頒布法令,禁止從動(dòng)物血液中提取的SOD用于人類(lèi)。而從植物中提取SOD的方法往往受到原材料的制約,且成本較高。微生物具有原料便宜易得,可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì),因而,近些年很多學(xué)者都致力于用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SOD的研究[3]。目前,國(guó)內(nèi)外在微生物SOD的菌種選育、發(fā)酵工藝、分離提純、生理學(xué)研究、基因克隆表達(dá)及SOD應(yīng)用方面都取得一定的研究進(jìn)展[4-5]。

    大腸桿菌基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善,繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定,本研究將人銅鋅SOD基因克隆并表達(dá)于大腸桿菌中,雖然獲得高效表達(dá),但主要以包涵體形式表達(dá),可溶性蛋白表達(dá)量很少。原因可能是大腸桿菌表達(dá)外源基因存在以下問(wèn)題:(1)缺乏對(duì)真核生物蛋白的修飾加工系統(tǒng);(2)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白;(3)細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有較多的內(nèi)毒素。在商業(yè)應(yīng)用中很多的蛋白產(chǎn)物是真核基因編碼,并且具有高級(jí)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu),要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細(xì)胞的分子環(huán)境和折疊機(jī)制等與真核細(xì)胞具有很大的差異,所以在應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)真核基因時(shí)有必要利用代謝工程或進(jìn)化的方法改造細(xì)胞,解決大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的局限性,提高產(chǎn)物的活性[6]。

    由于受到(1)半衰期短;(2)相對(duì)分子質(zhì)量大,不易透過(guò)細(xì)胞膜;(3)口服時(shí)易受胃蛋白酶分解;(4)體內(nèi)特異性等因素的限制,SOD很難作為藥用酶廣泛應(yīng)用于臨床中[7]。因此,希望在不久的將來(lái)能合成出具有精確活性中心結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)穩(wěn)定的和動(dòng)力學(xué)惰性的模擬物,從而使SOD作為一種高效、安全的功能因子在產(chǎn)業(yè)中擁有廣泛的實(shí)用前景。

    [1]MannT,Keilin D.Haemocuprein and hepatocuprein,copper-protein compounds of blood and liver in mammals[J].Proc R Soc B,1938,126(844):303-315.

    [2]MeCord JM,Irwin F.Superoxide dismutase:an enzymatic function for erythrocuprein(hemocuprein)[J].J Biol Chem,1969,244:6049-6055.

    [3]張欣.超氧化物歧化酶(SOD)及其研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古石油化工,2010,(16):14-15.

    [4]王素芳,蔣琳蘭,趙樹(shù)進(jìn).微生物超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2002,9(6):378-380.

    [5]楊明琰,張曉琦.微生物產(chǎn)超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2004,24(1):49-51.

    [6]戎晶晶,刁振宇,周?chē)?guó)華.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2005,12(6):416-420.

    [7]馬曉麗.超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,20(1):83-86.

    Expression of Recombinant Human Superoxide Dismutase in Escherichia coli

    WANG Lan1,2,LIU Xin1,2,ZHANG Fan3,XIAO Chunling1*
    (1.Key laboratory of Environmental Pollution and Microecology,Shenyang 110034,China;2.Department of Pathogenic Biology,Shenyang Medical College;3.Grade 2011 Class 2,Shenyang Medical College)

    Objective:To construct human copper zinc superoxide dismutase(hCu,Zn-SOD)prokaryotic expression vector and to purify and identify in order to lay the foundation of clinical application.Methods:RT-PCR technology was used to amplify SOD cDNA according to the reported sequence of hCu,Zn-SOD gene derived from peripheral blood mononuclear cells(PBMC).The resulting PCR product was inserted into the prokaryotic expression vector pET22b(+).The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosseta(DE3)after verifing by enzyme digestion,PCR and sequencing identification.The target protein was expressed by IPTG induction and purified by nickel affinity immobilized metal chromatography.The biological activity of SOD was determined by xanthine oxidase method.Results:Sequence analysis showed that 465 bp nucleotide in mature peptide encoding region was consistent with SOD sequence reported in GenBank(X02317).After induced by IPTG and SDS-PAGE electrophoresis analysis,the recombinant protein was expressed and molecular weight was about 19 kD.But soluble protein expression was rarely and mainly in the form of inclusion body expression.The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA agarose.Biological activity of soluble protease was 460 U/ml(SOD specific activity was 630 U/mg).Conclusion:High expression of human SOD is obtained from Escherichia coli,which laid the foundation for the study on its biological functions and wide application.

    superoxide dismutase(SOD);Escherichia coli;expression

    Q786

    A

    1008-2344(2015)02-0070-04 doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.02.002

    2015-02-07

    沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科技開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目(No.20146069)

    王嵐(1976—),女(漢),副教授,醫(yī)學(xué)博士.研究方向:院內(nèi)感染細(xì)菌耐藥機(jī)制研究.E-mail:wanglan1123@ aliyun.com

    肖純凌(1964—),女(漢),教授,博士.研究方向:大氣污染與微生態(tài).E-mail:xiaochunling@symc.edu.cn

    猜你喜歡
    歧化酶超氧化物醫(yī)學(xué)院
    新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
    同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院介紹
    A Study of Blended-teaching Model in Medical English
    包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院
    新型耐高溫超氧化物歧化酶SOD的產(chǎn)業(yè)化
    超氧化物歧化酶保健飲用水及其制取方法探討
    麥苗中超氧化物歧化酶抗氧化活性研究
    观看免费一级毛片| 日本色播在线视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美少妇被猛烈插入视频| 午夜福利高清视频| 搞女人的毛片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美一区二区亚洲| 日本免费在线观看一区| 观看免费一级毛片| 久久久色成人| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美精品专区久久| 国产 一区精品| 涩涩av久久男人的天堂| 69av精品久久久久久| av天堂中文字幕网| 精品一区二区三卡| 激情五月婷婷亚洲| 一级毛片 在线播放| 国产一区二区三区av在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩伦理黄色片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人精品婷婷| 丰满人妻一区二区三区视频av| 色网站视频免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲精品456在线播放app| 99久久精品国产国产毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美成人a在线观看| 国产男女内射视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 91精品一卡2卡3卡4卡| 天堂网av新在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久亚洲国产成人精品v| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲美女视频黄频| 黄片无遮挡物在线观看| 国产一区二区三区av在线| 看非洲黑人一级黄片| 国产乱人视频| 亚洲av二区三区四区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费在线观看成人毛片| 在线观看国产h片| 夫妻午夜视频| 少妇人妻 视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 制服丝袜香蕉在线| 97在线人人人人妻| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 少妇高潮的动态图| 麻豆成人午夜福利视频| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲国产日韩一区二区| 看免费成人av毛片| 成人综合一区亚洲| 嫩草影院入口| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品av视频在线免费观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品人妻偷拍中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品一区二区性色av| 身体一侧抽搐| 亚洲av中文av极速乱| 日本与韩国留学比较| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久欧美国产精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 人妻 亚洲 视频| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品第二区| 青春草国产在线视频| 乱系列少妇在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费观看a级毛片全部| 成人国产麻豆网| 少妇的逼好多水| 精品久久国产蜜桃| 精品国产三级普通话版| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产有黄有色有爽视频| 免费看光身美女| 国产v大片淫在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 春色校园在线视频观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲av免费在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 人妻 亚洲 视频| kizo精华| 99久久精品一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 成人欧美大片| 中文字幕久久专区| 午夜视频国产福利| 国产探花极品一区二区| 插逼视频在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 夫妻性生交免费视频一级片| 波野结衣二区三区在线| 日本免费在线观看一区| 制服丝袜香蕉在线| 久久热精品热| av在线蜜桃| 国产永久视频网站| 色5月婷婷丁香| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 高清欧美精品videossex| 大片免费播放器 马上看| 欧美激情在线99| 大香蕉97超碰在线| 水蜜桃什么品种好| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产淫片久久久久久久久| 午夜爱爱视频在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 青春草国产在线视频| 久热久热在线精品观看| 成年免费大片在线观看| 秋霞在线观看毛片| 久久久久精品性色| 在线免费十八禁| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男男h啪啪无遮挡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费电影在线观看免费观看| 成人国产麻豆网| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品无大码| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜视频国产福利| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲高清免费不卡视频| 日韩亚洲欧美综合| 国产亚洲精品久久久com| 五月天丁香电影| 美女高潮的动态| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲精品一二三| 欧美日本视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品视频人人做人人爽| 国产欧美亚洲国产| 亚洲电影在线观看av| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 成人国产av品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久成人免费电影| av一本久久久久| 国精品久久久久久国模美| 老司机影院成人| 亚洲av不卡在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美 日韩 精品 国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 内射极品少妇av片p| 亚洲精品一区蜜桃| 丝袜喷水一区| 亚洲国产精品999| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区精品91| 日韩三级伦理在线观看| 色吧在线观看| 一级片'在线观看视频| 久久久久久久午夜电影| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精品影视一区二区三区av| 春色校园在线视频观看| 人妻系列 视频| tube8黄色片| 99久久精品一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 在线精品无人区一区二区三 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 91精品国产九色| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 免费人成在线观看视频色| 亚洲在久久综合| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品视频女| 亚洲国产av新网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 男女国产视频网站| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲国产欧美人成| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品人妻熟女av久视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美激情国产日韩精品一区| 中文天堂在线官网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧洲日产国产| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久久久久丰满| 欧美高清成人免费视频www| 国产熟女欧美一区二区| 男女边摸边吃奶| 各种免费的搞黄视频| 偷拍熟女少妇极品色| 99久久精品国产国产毛片| 极品教师在线视频| 看黄色毛片网站| kizo精华| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲自拍偷在线| 亚洲自拍偷在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av免费在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产真实伦视频高清在线观看| 在线看a的网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇人妻久久综合中文| 一级二级三级毛片免费看| 一本久久精品| 99热这里只有精品一区| 国产伦理片在线播放av一区| 永久免费av网站大全| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜福利视频精品| 亚洲成人一二三区av| 成人综合一区亚洲| 免费少妇av软件| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕亚洲精品专区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 联通29元200g的流量卡| 日本熟妇午夜| 制服丝袜香蕉在线| 少妇人妻久久综合中文| 一个人观看的视频www高清免费观看| 性色av一级| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 色综合色国产| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产男女内射视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲在线观看片| 1000部很黄的大片| 亚洲av.av天堂| 激情 狠狠 欧美| 国产一级毛片在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看一区二区三区激情| a级一级毛片免费在线观看| 欧美潮喷喷水| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 91久久精品国产一区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美日韩综合久久久久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品伦人一区二区| 成年免费大片在线观看| 韩国av在线不卡| 亚洲最大成人手机在线| 真实男女啪啪啪动态图| 国产av码专区亚洲av| 亚洲熟女精品中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 91久久精品电影网| 亚洲av日韩在线播放| 日本与韩国留学比较| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精品影视一区二区三区av| 热99国产精品久久久久久7| 国产91av在线免费观看| 大香蕉久久网| 国产 一区精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 秋霞在线观看毛片| 中文资源天堂在线| 最近中文字幕2019免费版| 国产成人一区二区在线| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品一区蜜桃| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲自偷自拍三级| 国模一区二区三区四区视频| 午夜爱爱视频在线播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久综合国产亚洲精品| 国产一级毛片在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 色综合色国产| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 97超视频在线观看视频| 下体分泌物呈黄色| a级一级毛片免费在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久久久久久精品精品| av在线天堂中文字幕| 久久99热这里只频精品6学生| 国产成人免费无遮挡视频| 老司机影院成人| 青春草视频在线免费观看| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文欧美无线码| 一级a做视频免费观看| 在线观看免费高清a一片| 水蜜桃什么品种好| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久国产电影| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产精品女同一区二区软件| 天天躁日日操中文字幕| 内地一区二区视频在线| 国产熟女欧美一区二区| 午夜激情久久久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品一二三| 街头女战士在线观看网站| 国产精品女同一区二区软件| 久久综合国产亚洲精品| 精品人妻熟女av久视频| 日韩国内少妇激情av| 最新中文字幕久久久久| 69av精品久久久久久| av黄色大香蕉| 在线天堂最新版资源| 欧美精品国产亚洲| 欧美xxxx性猛交bbbb| 看黄色毛片网站| 男女边摸边吃奶| 亚洲自拍偷在线| 国精品久久久久久国模美| 国产乱人偷精品视频| 身体一侧抽搐| 国国产精品蜜臀av免费| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品99久久久久久久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男女那种视频在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品一二三区在线看| 黄色日韩在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产一级毛片在线| 一个人看的www免费观看视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久网色| av在线亚洲专区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品国产av成人精品| 免费少妇av软件| 久久热精品热| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 尾随美女入室| 国内揄拍国产精品人妻在线| 下体分泌物呈黄色| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费观看无遮挡的男女| 在线免费十八禁| 亚洲国产精品999| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 乱系列少妇在线播放| 人人妻人人看人人澡| 久久久亚洲精品成人影院| 69人妻影院| 午夜免费观看性视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 黄色怎么调成土黄色| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久99精品国语久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲国产精品成人综合色| 香蕉精品网在线| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧洲日产国产| 欧美丝袜亚洲另类| 一个人看的www免费观看视频| 久久久久久伊人网av| 成年免费大片在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲天堂av无毛| videossex国产| 真实男女啪啪啪动态图| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲av一区综合| 国产乱人偷精品视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产日韩一区二区| 精品一区二区免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 99久久精品一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 久久久久九九精品影院| 不卡视频在线观看欧美| 久久精品综合一区二区三区| 色视频www国产| 熟女电影av网| 日韩强制内射视频| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品亚洲一区二区| 六月丁香七月| 97超碰精品成人国产| 色吧在线观看| 热re99久久精品国产66热6| av天堂中文字幕网| 日韩av免费高清视频| 99热这里只有精品一区| 国产永久视频网站| 国产精品久久久久久av不卡| 国产免费又黄又爽又色| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久精品国产亚洲网站| 国产有黄有色有爽视频| 成人漫画全彩无遮挡| 在线观看一区二区三区激情| av免费观看日本| 色播亚洲综合网| 人妻一区二区av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲人与动物交配视频| 成年免费大片在线观看| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久精品精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 少妇人妻 视频| 成人二区视频| 交换朋友夫妻互换小说| videossex国产| 国产毛片在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热这里只有是精品50| 日韩精品有码人妻一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人毛片60女人毛片免费| videossex国产| 亚洲最大成人中文| 欧美另类一区| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 高清午夜精品一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久精品国产自在天天线| 亚洲人与动物交配视频| 大话2 男鬼变身卡| 在线观看国产h片| 日韩一区二区视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 97精品久久久久久久久久精品| 两个人的视频大全免费| 中国国产av一级| 国产精品人妻久久久久久| 欧美精品国产亚洲| 丝袜喷水一区| 日本午夜av视频| 国产精品一二三区在线看| 两个人的视频大全免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | a级毛色黄片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人a∨麻豆精品| 波野结衣二区三区在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人免费观看视频高清| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 99re6热这里在线精品视频| 黄色怎么调成土黄色| www.av在线官网国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 91久久精品国产一区二区三区| 夜夜爽夜夜爽视频| www.色视频.com| 欧美高清性xxxxhd video| 国产黄色免费在线视频| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩强制内射视频| 成年女人在线观看亚洲视频 | 91精品国产九色| av在线观看视频网站免费| 亚洲欧美一区二区三区国产| 九九在线视频观看精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国国产精品蜜臀av免费| 高清在线视频一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品久久久久久精品古装| 中文字幕av成人在线电影| 人妻少妇偷人精品九色| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 三级经典国产精品| 91久久精品国产一区二区成人| 美女被艹到高潮喷水动态| 高清av免费在线| 黄色欧美视频在线观看| 色吧在线观看| 国产久久久一区二区三区| 少妇丰满av| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品视频女| a级毛色黄片| 日日啪夜夜撸| 一级黄片播放器| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲成人久久爱视频| 1000部很黄的大片| 乱系列少妇在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 最后的刺客免费高清国语| 成人亚洲精品一区在线观看 | 少妇被粗大猛烈的视频| 特大巨黑吊av在线直播| 久久99蜜桃精品久久| 国产乱来视频区| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品夜色国产| 久久热精品热| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩 亚洲 欧美在线| 色网站视频免费| 国产精品熟女久久久久浪| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 国精品久久久久久国模美| 十八禁网站网址无遮挡 | 少妇 在线观看| 中文天堂在线官网| 国产中年淑女户外野战色| 日本与韩国留学比较| 色视频www国产| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲成人一二三区av| 日本午夜av视频| 国产爽快片一区二区三区| 精品久久久久久电影网| videos熟女内射| 一边亲一边摸免费视频| 在线播放无遮挡| 综合色丁香网| 波野结衣二区三区在线| 男插女下体视频免费在线播放| 白带黄色成豆腐渣| 精品久久久久久久末码| av.在线天堂| 国产 精品1| 国产极品天堂在线| 免费看日本二区| 视频区图区小说| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 啦啦啦在线观看免费高清www| 人妻 亚洲 视频| 中国国产av一级| 国产成人精品福利久久| 久久久久九九精品影院| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 午夜激情福利司机影院| 国产精品福利在线免费观看|