離子交換層析法分離豬股骨降血壓肽的研究

舒一梅，李　誠，鄭麗君，潘姝璇，陳　娜，郭　威，王詩熠，付　剛（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

離子交換層析法分離豬股骨降血壓肽的研究

舒一梅，李誠*，鄭麗君，潘姝璇，陳娜，郭威，王詩熠，付剛
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

豬股骨酶解液經(jīng)超濾、凝膠層析初步分離后，為了得到高活性且純度較高的降血壓肽，采用離子交換層析對凝膠層析分離后的高活性組分進(jìn)一步分離。通過對洗脫液pH、離子強度、流速三個因素進(jìn)行研究，確定了最佳分離條件：以pH=6.0、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液為A液、B液為含1mol/LNaCl的pH=6.0、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為0.8mL/min。結(jié)果顯示：離子交換層析分離得3個組分，其中組分1的活性最高，其IC50值為0.1012mg/mL；再利用凝膠層析將組分1進(jìn)行脫鹽，其峰2的IC50值達(dá)到0.0836mg/mL，脫鹽率達(dá)到86.60%±0.5%。

酶解，降血壓肽，離子交換層析，凝膠層析，ACE半抑制濃度

降血壓肽具有來源廣泛、降壓效果理想、天然低毒副作用等特點，是國內(nèi)外一直研究的熱點。利用廉價的豬股骨為原料，采用酶解的方法可以得到具有降血壓活性的酶解液，但酶解液組成成分復(fù)雜，不利于降壓產(chǎn)品的開發(fā)，必須進(jìn)一步分離純化［1-2］。離子交換層析是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，與化學(xué)方法相比，它分離條件溫和，不引起分子結(jié)構(gòu)的變化［3-4］，具有靈敏度高、重復(fù)性、選擇性好、分析速度快等特點，常用的有離子交換樹脂、離子交換葡聚糖、離子交換纖維和離子交換瓊脂糖等。目前，離子交換色譜已經(jīng)成為分離提取生物活性肽的最常用的有效方法，生物活性肽通過靜電作用與固定相中的帶電基團(tuán)結(jié)合，由于不同活性肽具有不同電荷和電荷量，所以解吸及移動速度不同，從而可以實現(xiàn)分離［5-6］。

本實驗室所制備酶解液經(jīng)超濾、凝膠層析分離之后得到的組分純度不高，為得到純度較高的高活性降血壓肽，采用離子交換層析進(jìn)一步分離，以期分離出高純度的豬股骨降血壓肽，開發(fā)以其為功能因子的保健食品或治療高血壓的藥物具有較高的實用價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬股骨骨粉實驗室自制；Sephadex G-25 BIORAD公司；陽離子交換樹脂BIORAD公司；木瓜蛋白酶（800U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20U/mg）、堿性蛋白酶（200U/mg） DSM公司；ACE、HHL美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

蛋白層析儀BIORAD公司；超濾管（5ku） 密理博公司；QT-2漩渦混勻器上海琪特分析儀器有限公司；UV-3200 MAPADA紫外分光光度計；冷凍干燥機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、移液槍Thermo Fisher；超純水裝置優(yōu)普公司；pH計方舟科技；層析柱1.6cm× 60cm1cm×20cm上海滬西分析儀器廠；BSZ-100型自動部分收集上海滬西分析儀器廠；WLB-78C恒流泵浙江新昌國康儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1豬股骨降血壓肽的制備按照實驗室前期豬股骨酶解降血壓肽的優(yōu)選條件制備豬股骨降血壓肽，其工藝流程為：新鮮豬股骨→清洗→高壓蒸煮→粉碎→加酶水解→滅酶→離心→上清液→冷凍干燥［7］。將酶解液用截留分子質(zhì)量為5ku的超濾管進(jìn)行超濾，凍干備用。1.2.2凝膠層析分離將超濾后分子量＜5ku的濾液通過Sephadex G-25進(jìn)行凝膠層析分離，分離條件為：去離子水為洗脫液，控制流速為0.6mL/min，上樣量為1%（以床體積的百分比計算），檢測波長為214nm。

1.2.3離子交換層析分離操作步驟根據(jù)目的多肽的性質(zhì)來選擇合適的離子交換填料［8-9］。本實驗選用UNO-S陽離子交換樹脂進(jìn)行分離［10-11］。為了達(dá)到最好的分離效果，本實驗探討了洗脫液pH、離子強度以及流速對分離效果的影響。

采用蛋白層析儀對收集凝膠層析后的高活性組分進(jìn)行線性梯度洗脫，以UNO-S陽離子交換樹脂為填料。用超純水將蛋白層析儀的AB泵沖開，用A（不同pH的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液）液平衡柱子，再上樣（每一條件進(jìn)行6次以上平行實驗，直到每次平行實驗的分離圖譜一致）。利用A液和B液（含1mol/L NaCl的不同pH的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液）進(jìn)行線性梯度洗脫，其洗脫程序為：A液100%～0、B液0～100%，收集洗脫液，清洗交換劑、管道和裝置。結(jié)合每管在214nm的吸光度值，考察不同流速、離子強度、pH對分離效果的影響，測定各組分IC50值，收集體外ACE抑制率最高的組分。

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1不同pH洗脫液對分離效果的影響B(tài)液為含1mol/L NaCl的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，控制流速為1mL/min。分別采用不同pH的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液為A液，設(shè)定不同pH為：6.0、6.5、7.0，研究不同pH的洗脫液對分離純化效果的影響，確定最適pH。

1.2.4.2不同離子強度對分離效果的影響采用pH=6.5，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液為A液，B液為含不同量NaCl的pH=6.5，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，控制流速為1mL/min，設(shè)定不同離子強度（mol/L）為：0.5、1.0、1.5?？疾觳煌x子強度對分離純化效果的影響，確定最適離子強度。

1.2.4.3不同流速對分離效果的影響采用pH= 6.5，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液為A液，B液為含1mol/L NaCl的pH=6.5，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，設(shè)定不同流速（mL/min）為：0.8、1.0、1.2?？疾觳煌魉賹Ψ蛛x純化效果的影響，確定最適流速。

1.2.5脫鹽經(jīng)離子交換層析后，得到的高活性豬股骨降血壓肽組分含有大量的鹽，為了進(jìn)一步提高其ACE抑制活性，采用Sephadex G-25為填料，對該組分進(jìn)行脫鹽，重復(fù)該實驗6次［12-13］。采用國標(biāo)中的硝酸銀滴定法測定脫鹽率［14］。

1.2.6指標(biāo)的測定

1.2.6.1ACE抑制率的測定ACE抑制率的測定主要采用紫外分光光度法［15-16］。

1.2.6.2IC50值測定方法將樣品配制成不同的濃度（實驗點≥5），分別測定其ACE抑制率，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制率為縱坐標(biāo)，繪制圓滑曲線，用對數(shù)幾率圖解法計算出IC50值。

1.2.6.3蛋白質(zhì)濃度的測定蛋白質(zhì)濃度的測定主要采用Lowry法蛋白含量檢測試劑盒測定。

2　結(jié)果與分析

2.1凝膠層析分離

分離出的組分2的抑制率最高，如圖1，經(jīng)計算其IC50值為0.4016mg/mL。

圖1　凝膠層析分離曲線Fig.1　The separation pattern of gel chromatography

2.2離子交換層析分離

2.2.1不同pH洗脫液對分離效果的影響由圖2知，洗脫液的pH對分離效果影響較大，當(dāng)pH為6.0時，可以得到3個峰，當(dāng)pH為6.5時，也能得到3個峰，但與pH=6.0相比，峰1峰型較圓、峰2和峰3分離程度不如前者，當(dāng)pH為7.0時，只能得到2個峰，分離效果不佳，因此洗脫液的pH選用6.0。

2.2.2不同離子強度對分離效果的影響由圖3知，離子強度對分離效果影響并不大，在各個離子強度下，都分離出了3個峰，綜合考慮成本以及峰型這兩方面，采用1mol/L的離子強度較合適。

2.2.3不同洗脫流速對分離效果的影響由圖4知，流速對分離效果影響較大。在流速為0.8、1.0mL/min的條件下，能分離出3個峰，前者峰1較后者尖，前者分離較好。但當(dāng)流速為1.2mL/min時，只能得到2個峰，未能分開峰2與峰3。因此，為了保持較高的分離效果，采用0.8mL/min的分離速度。

2.2.4確定最佳分離條件綜合以上得出最佳洗脫條件：采用pH=6.0磷酸鹽緩沖液為A液，B液為含1mol/L NaCl的pH=6.0，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為0.8mL/min。將凝膠層析分離后的組分2冷凍干燥配成蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL，按優(yōu)選的最佳分離條件再進(jìn)行多次驗證，如圖5。在此區(qū)間形成3個洗脫峰，分別測定IC50值。測得其中組分1的抑制率最高，如圖6，其IC50值為0.1012mg/mL，表明該分離條件穩(wěn)定可行。

圖2　不同pH的分離圖譜Fig.2　The separation pattern of different pH

2.2.5脫鹽離子交換層析后所得到的組分1經(jīng)凝膠層析脫鹽后，得到了兩個洗脫峰，通過測定其IC50值，發(fā)現(xiàn)峰2有較高的ACE抑制活性，其IC50值為0.0836mg/mL（峰1 IC50值為0.3612mg/mL），較脫鹽之前活性提高了1.3倍，其脫鹽率達(dá)到了86.6%±0.5%。洗脫曲線如圖7所示。

洗脫液pH、離子強度、流速三個因素對分離豬股骨降血壓肽有不同程度的影響。離子強度過大或小都會導(dǎo)致分離不開，流速過大也使分離效果不佳，流速過小又會降低分離效率，本研究探索出的最佳的分離條件為豬股骨降血壓肽產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定實驗基礎(chǔ)。經(jīng)離子交換分離的高活性組分的脫鹽也是純化的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的脫鹽方法透析、納濾等不適用小分子的脫鹽，適用的電滲析脫鹽又能源消耗大，回收率低。而凝膠層析脫鹽操作簡便，成本低，回收率高，脫鹽效果好。

圖3　不同離子強度的分離圖譜Fig.3　The separation pattern of different ionic strength

國內(nèi)外也有較多的學(xué)者利用離子交換層析研究不同蛋白源的降血壓肽的分離純化，如李世敏等［17］利用玉米蛋白酶解得到的酶解液，用離子交換層析進(jìn)行初步分離，得到的組分中活性最高的ACE抑制率比酶解液的抑制率高出一倍。Leslie等［18］利用離子交換層析分離出高活性的苜蓿蛋白降血壓肽，等等。降血壓肽沒有特定的功能基團(tuán)，所以采用簡單直接的分離方法無法分離出單體，采用膜分離技術(shù)、凝膠層析技術(shù)、離子交換層析等多種手段相結(jié)合，以使分離出單一的豬股骨降血壓肽組分，促進(jìn)豬股骨降血壓肽的工業(yè)化生產(chǎn)。

3　結(jié)論

通過離子交換層析，分離到了活性較高豬股骨降血壓肽，其IC50值為0.1012mg/mL，確定了最佳洗脫條件為：以pH=6.0磷酸鹽緩沖液為A液，B液為含1mol/L NaCl的pH=6.0，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為0.8mL/min。再經(jīng)過脫鹽后，分離出的豬股骨降血壓肽活性提高到了0.0836mg/mL，脫鹽率達(dá)到86.6%±0.5%，較劉小紅等［7］用離子交換層析分離的降血壓肽組分的ACE抑制活性提高了5.8倍。

圖4　不同流速的分離圖譜Fig.4　The separation pattern of different flow rates

圖5　最佳洗脫曲線Fig.5　The best separation pattern of Antihypertensive Peptides

圖6　各個組分的IC50值Fig.6　The IC50of each component

圖7　組分1的脫鹽洗脫曲線Fig.7　The separation pattern of peak 1 after desalination

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Separation and purification of pig femoral collagen antihyper-tensive peptides by ion exchange chromatography

SHU Yi-mei，LI Cheng*，ZHENG Li-jun，PAN Shu-xuan，CHEN Na，GUO Wei，WANG Shi-yi，F(xiàn)U Gang
（College of Food，Sichuan Agriculture University，Ya’an 625014，China）

In order to obtain high activity and purity of antihypertensive peptides，the method of ion exchange chromatography was used to separat the solution afterthe preliminary separation and charactenization by ultrafiltration and gel permeation chromatography.The eluent pH，ionic strength，velocity of the three factors were studied.The optimal conditions for analysis were as follows：elution of pH=6.0，the flow rate was 0.8mL/min，the ionic strength was 1.0mol/L.The results showed that the fraction was then purified by ion exchange chromatography into 3 peaks，in which peak 1 had the strongest ACE inhibitory activity with an IC50of 0.1012mg/mL.And the peak 1 was further desalinationted by gel permeation chromatography to obtain 4 peaks，and the peak 2 had the highest ACE-inhibitory activity with an IC50of 0.0836mg/mL，the desalination rate 86.60%±0.5%.

enzymolysis liquid；antihypertensive peptides；ion exchange chromatography；gel chromatography；half inhibitory concentration of ACE

TS251

B

1002-0306（2015）02-0253-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.046

2014－06－06

舒一梅（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全。

李誠（1964-），男，碩士研究生，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。