企鵝珍珠貝肉蛋白酶解及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

侯　睿，易美華，*，鐘秋平，馮永勤（.海南大學食品學院，海南?？?708；.海南大學海洋學院，海南海口5708）

企鵝珍珠貝肉蛋白酶解及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

侯睿1，易美華1，*，鐘秋平1，馮永勤2
（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南大學海洋學院，海南?？?70228）

用水解蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶對企鵝珍珠貝蛋白進行水解，以酶解液中的氨基態(tài)氮及風味為指標，確定風味蛋白酶為水解企鵝珍珠貝蛋白的最適蛋白酶，單因素及正交實驗確定風味蛋白酶的最佳水解條件為：加酶量0.8%、溫度55℃、起始pH6.0、固液比1∶1.0、酶解6h后的氨基酸態(tài)氮為3.65g/100mL?？寡趸瘜嶒灡砻鳎附猱a(chǎn)物具有較強的羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基抑制及還原能力。研究結(jié)果將為企鵝珍珠貝肉的開發(fā)提供參考。

企鵝珍珠貝，蛋白酶，水解，抗氧化性

企鵝珍珠貝（Pteria penguin）是珍珠貝屬的一種可生產(chǎn)大規(guī)格附殼珠和正圓珠的大型貝類，在我國廣西、廣東、臺灣和海南都有分布，是我國南方海水珍珠養(yǎng)殖最主要的品種之一［1］。在主產(chǎn)地海南，企鵝珍珠貝的養(yǎng)殖數(shù)量僅次于馬氏珠母貝［2］，采珠后的珍珠貝肉數(shù)量相當可觀。目前這些貝肉只有小部分用于鮮食或加工成干制品，大部分用于飼料，利用率較低，其潛在價值未得到充分利用［3］。目前，國內(nèi)學者對于企鵝珍珠貝肉的開發(fā)研究較少，廖艷等［4-5］對企鵝珍珠貝肉的一般化學組成及鎘的分布進行了初探，還對企鵝珍珠貝肉的營養(yǎng)液進行了研制。吳曉萍等［6］對企鵝珍珠貝全臟器的營養(yǎng)成分進行了分析與評價。左光揚等［7］對企鵝珍珠貝肉進行了酶解產(chǎn)物的制備及醒酒作用的初步研究。本研究利用企鵝珍珠貝肉為原料，對其酶解條件及酶解液的抗氧化性進行研究，旨在為企鵝珍珠貝肉的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

企鵝珍珠貝采集于海南省陵水縣黎安港海南后浪珍珠有限公司養(yǎng)殖場，開珠后及時收集貝肉，急凍后置冷凍柜-18℃保存；水解蛋白酶（Alcalase）酶活0.6AU/g、復合蛋白酶（Protamex）酶活1.04×105U/g、風味蛋白酶（Flavorzyme）酶活1.5AU/g、中性蛋白酶（Neutrase）酶活0.5AU/g購自諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

Waters 2695高效液相色譜儀美國沃特斯公司；Sorvall Stratos全能臺式高速冷凍離心機德國賽默飛世爾科技實驗室產(chǎn)品部；723N可見分光光度計上海精科有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市晶玻實驗儀器廠；PL3003電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C雷磁酸度計上海精密科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蛋白酶的篩選取自然解凍的企鵝珍珠貝肉50g，加一定比例的蒸餾水勻漿1min，按0.2g/100g企鵝珍珠貝肉分別加水解蛋白酶（55℃、pH6.5）、復合蛋白酶（50℃、pH7.0）、中性蛋白酶（45℃、pH6.0）和風味蛋白酶（50℃、pH6.5），恒溫水解4h。酶解完畢，于沸水浴中滅酶15min，6000r/min離心15min，用定性濾紙過濾，所得濾液為酶解液，測氨基酸態(tài)氮的含量［8］。根據(jù)測得的氨基酸態(tài)氮含量和水解液的氣味選擇最佳蛋白酶。

1.2.2最適蛋白酶酶解條件的單因素實驗

1.2.2.1不同起始pH對酶解的影響在溫度為50℃、加酶量為0.4%、固液比1∶1.0、不同起始pH條件下恒溫水解4h。酶解完畢，酶解液的處理同1.2.1。

1.2.2.2不同酶解溫度對酶解的影響在pH6.0、加酶量為0.4%、固液比1∶1.0、不同溫度條件下恒溫水解4h。酶解完畢，酶解液的處理同1.2.1。

1.2.2.3不同水解時間對酶解的影響在pH6.0、溫度為50℃、固液比1∶1.0、加酶量為0.4%的條件下恒溫水解不同的時間。酶解完畢，酶解液的處理同1.2.1。1.2.2.4不同加酶量對酶解的影響在pH6.0、溫度為50℃、固液比1∶1.0、不同加酶量下恒溫水解4h。酶解完畢，酶解液的處理同1.2.1。

1.2.2.5不同固液比對酶解的影響在pH6.0、溫度為50℃、加酶量0.8%、固液比分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5條件下酶解6h。酶解完畢，酶解液的處理同1.2.1。

1.2.3最適蛋白酶酶解條件的正交實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果，得到水解時間、溫度、加酶量、起始pH和固液比的有效作用范圍，選用L16（45）正交表進行正交實驗，實驗水平及編碼見表1。

表1　正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.2.4粗蛋白含量測定凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010。

1.2.5氨基酸態(tài)氮測定甲醛滴定法，參照GB/T 5009.39-2003。

1.2.6氨基酸分析水解液中游離氨基酸組成采用HPLC分析。

1.2.6.1氨基酸檢測條件AccQ-Tag氨基酸分析柱，溫度38℃，流速1.0mL/min，檢測波長254nm。

1.2.6.2外標法標樣制備AccQ-Tag化學組成試劑中提供17種水解氨基酸的標樣，每種氨基酸（除Cys以外）的濃度均為2.5μmol/mL。取40μL水解氨基酸標樣置于清潔的自動進樣瓶中，加入960μL Milli-Q水，混勻。此標樣含胱氨酸50pmoL/μL（等價于100pmoL/μL半胱氨酸），其他各種氨基酸均為100pmoL/μL。

1.2.6.3定量測定根據(jù)未知樣的濃度，將標樣稀釋成相應濃度得到合適的標準曲線。

1.2.7酶解液抗氧化性測定酶解液的還原力［9］：取不同濃度的酶解液2.5mL，加入2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液混勻，在50℃條件下保溫20min后再加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min，取上清液2.5mL、蒸餾水2.5mL和0.5mL 0.1%的三氯化鐵，混勻后靜置10min，然后在700nm波長處測定其吸光度。吸光值越大，表示還原能力越強。

1.2.7.1羥基自由基抑制活性［10］在25mL試管中加入4.5mmol/L硫酸鐵溶液2mL，4.5mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，4.9mmol/L的過氧化氫溶液2mL立即混勻，然后加不同濃度的酶解液樣品各2mL，以等體積的蒸餾水作空白對照，37℃水浴30min，在510nm處測吸光度。

1.2.7.2超氧陰離子自由基抑制活性［10］取50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5mL，加入4.2mL不同濃度的酶解液（空白加去離子水）和3mmol/L鄰苯三酚0.3mL，混勻后25℃水浴保溫20min，加入8mol/L HCl 1滴終止反應，于325nm測吸光值。

1.2.7.3DPPH自由基抑制活性的測定［11］將2mL蒸餾水，2mL不同濃度水解液分別與2mL 0.1mmol/L的DPPH溶液混合均勻，在溫度為30℃條件下，靜置反應30min，在波長517nm處測吸光值，2mL樣品液加入2mL無水乙醇作為對照。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗重復3次，結(jié)果以3次實驗的平均值表示。實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進行分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1不同蛋白酶的酶解效果比較

企鵝珍珠貝肉粗蛋白質(zhì)含量為10.8g/100g鮮重，比馬氏珍珠貝肉蛋白含量14.4%略低［12］。

用4種不同蛋白酶對企鵝珍珠貝肉進行水解，復合蛋白酶、水解蛋白酶、中性蛋白酶及風味蛋白酶水解所得的氨基態(tài)氮含量分別為2.72、2.84、3.09、3.30g/100mL。復合蛋白酶的酶解效果最差，腥臭味最重，其次是水解蛋白酶，最好為風味蛋白酶，水解液基本沒有腥臭味。所以，實驗選用風味蛋白酶作為實驗用酶。

2.2不同反應條件對風味蛋白酶水解效果的影響

2.2.1單因素實驗

2.2.1.1不同起始pH對酶解的影響從圖1可以看出，在pH3～9的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，氨基態(tài)氮含量先增加后降低，pH7時最大值。這可能是由于pH低于或高于7時，抑制了蛋白酶的活性，氨基態(tài)氮含量降低。因此，最適的起始pH為7。

2.2.1.2不同溫度對酶解的影響由圖2可以看出，溫度低于60℃時，隨著溫度的升高，氨基態(tài)氮含量逐漸增大，當溫度高于60℃，氨基態(tài)氮含量明顯下降。酶是一種具有生物催化活性的蛋白質(zhì)，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高，酶促反應速度加快，但當溫度過高時，酶的結(jié)構(gòu)破壞遭到破壞，酶的活性降低甚至喪失［13］。所以，本實驗溫度選擇60℃。

圖1　不同起始pH對酶解的影響Fig.1　Effect of different initial pH on the hydrolysis by flavourzyme

圖2　不同溫度對酶解的影響Fig.2　Effect of temperature on the hydrolysis by flavourzyme

2.2.1.3不同水解時間對酶解的影響由圖3可知，隨著酶解時間的延長氨基態(tài)氮含量逐漸增大。水解時間由2h延長至3h，氨基態(tài)氮含量增加了0.24g/100mL，3～6h之間，水解時間每延長1h，氨基態(tài)氮含量增加的幅度皆在0.09g/100mL以上，當水解時間由6h延長至7h時，氨基態(tài)氮含量僅增加0.05g/100mL，增加的幅度最小。這可能是由于隨著酶解時間的延長，蛋白酶與底物充分接觸發(fā)生反應，在6h時酶解反應已基本完成。因此選擇6h為最佳酶解時間。

圖3　不同水解時間對酶解的影響Fig.3　Effect of different time on the hydrolysis by flavourzyme

2.2.1.4不同加酶量對酶解的影響由圖4可以看出，隨著酶量的增加，氨基態(tài)氮含量逐漸增加，當加酶量達到1.0%時，氨基態(tài)氮含量有下降的趨勢。這可能的原因是當加酶量達到一定值時，所有酶分子已被底物所飽和，即酶分子與底物結(jié)合部位已被占據(jù)［14］，氨基態(tài)氮含量不再增加。因此，0.8%的酶量已足夠。

圖4　不同加酶量對酶解的影響Fig.4　Effect of enzyme dosage on the hydrolysis by flavourzyme

2.2.1.5不同固液比對酶解的影響固液比的大小會影響酶和底物的結(jié)合效果，從而影響蛋白酶的水解效果。固液比低，底物濃度小，酶和底物結(jié)合不充分，反應不易進行；固液比高，底物濃度大，兩者接觸的機會減少。從圖5可以看出，固液比為1∶1.0時的酶解效果好于其他固液比時的酶解效果。所以，選用1∶1.0的固液比。

圖5　固液比對酶解的影響Fig.5　Effect of solid to liquid ratio on the hydrolysis by flavourzyme

2.2.2正交實驗結(jié)果正交實驗結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

由表2可以看出，對企鵝珍珠貝肉酶解效果影響最大的是時間，其次是加酶量和溫度，而pH影響最小。風味蛋白酶對企鵝珍珠貝肉的最佳酶解條件組合為：A4B3C4D2E2，即加酶量0.8%，溫度55℃，時間6h，起始pH6.0，固液比1∶1.0。最佳條件水解液中的氨基態(tài)氮含量可達3.65g/100mL。據(jù)方差分析可知，時間為顯著因素，其他三個因素不顯著。

2.3酶解液氨基酸分析

用HPLC對最佳水解條件下制備所得的酶解液進行游離氨基酸分析，結(jié)果如表4所示。

從表4可知，酶解液中共檢出17種氨基酸，總含量為3769.66mg/100mL。組氨酸、精氨酸、甘氨酸的量均超過300mg/100mL，特別是組氨酸的量占氨基酸總量的30%以上。組氨酸在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中屬于堿性氨基酸或?qū)儆谄銻基帶正電荷的極性氨基酸，在血紅蛋白分子病、酶活性等方面發(fā)揮重要作用［15］。

表2　風味蛋白酶L16（45）正交實驗結(jié)果及極差分析表Table 2　Results of L16（45）orthogonal test by flavourzyme and range analysis

表3　風味蛋白酶水解結(jié)果方差分析表Table 3　Variance analysis of hydrolysis results by flavourzyme

表4　企鵝珍珠貝肉酶解液的氨基酸組成Table 4　The amino acid composition of hydrolysate from Pteria penguin meat

2.4酶解液的抗氧化性

酶解液的抗氧化能力如表5所示。從表5可以看出，酶解液的還原能力隨著酶解液濃度的增加，還原能力逐漸增強。還原能力與樣品濃度之間存在明顯的量效關系。

表5　企鵝珍珠貝肉酶解液的抗氧化活性Table 5　Antioxidant activity of hydrolysate of Pteria penguin meat

酶解液對羥自由基有明顯的清除作用，在0.2～1.0mg/mL的濃度范圍內(nèi)，清除羥自由基的能力為79.07%～97.18%，且其對羥自由基的清除效果與樣品濃度之間存在明顯的量效關系。

酶解液對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用。在0.2～0.6mg/mL的樣品濃度范圍內(nèi)，超氧陰離子清除率在20.41%～34.57%，隨樣品濃度增大清除率升高的幅度較??；在0.6～1.0mg/mL的樣品濃度范圍內(nèi)，超氧陰離子清除率從34.57%直線躍升至68.42%。說明高濃度的酶解液具有較強的超氧陰離子自由基清除能力。

酶解液對DPPH自由基清除率從樣品濃度0.2mg/mL的79.07%升到1.0mg/mL的97.26%，存在明顯的量效關系。

3　結(jié)論

以氨基氮含量及外觀風味為指標，確定風味蛋白酶適用于企鵝珍珠貝肉的水解。經(jīng)單因素和正交實驗，得到風味蛋白酶的最佳水解條件為：加酶量0.8%、溫度55℃、起始pH6.0、固液比1∶1.0、酶解6h，產(chǎn)物氨基酸態(tài)氮含量為3.65g/100mL。從酶解液共檢出17種氨基酸，其中組氨酸含量最高，占總氨基酸總量的32.15%。通過對酶解液抗氧化活性的檢測，發(fā)現(xiàn)酶解液具有較強的抗氧化活性，且存在明顯的量效關系。

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Enzymatic hydrolysis and antioxidant activity of Pteria penguin meat by protease

HOU Rui1，YI Mei-hua1，*，ZHONG Qiu-ping1，F(xiàn)ENG Yong-qin2
（1.Food college，Hainan University，Haikou，570228，China；2.Ocean College，Hainan University，Haikou 570228，China）

Alcalase，protamex，neutrase and flavorzyme were tested for hydrolysis of Pteria penguin protein. Flavorzyme was found as the best one since its hydrolysate with highest concentration of amino acid nitrogen and good smell.The optimum hydrolytic conditions were as following：temperature 55℃，initial pH6.0，enzyme dosage 0.8%，and solid to liquid ratio 1∶1.0.Under this condition the value of amino acid nitrogen was 3.65g/100mL.The antioxidant and radical-scavenging activities of hydrolysates were evaluated using hydroxyl radical，superoxide anion free radical，DPPH free radical inhibitory activity and reducing power.All tested samples displayed strong antioxidant and radical-scavenging properties.The results will provide reference for development for Pteria penguin meat.

Pteria penguin；proteinase；hydrolysis；antioxidant activity

TS254.9

A

1002-0306（2015）02-0207-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.036

2014－05－20

侯睿（1993-），女，大學本科，研究方向：水產(chǎn)品加工。

易美華（1945-），女，大學本科，研究方向：水產(chǎn)品加工。

十二五國家科技支撐項目（2013BAB01B04）；海南省重大科技項目（DZDX2013014）。