共表達(dá)纖維素酶菌株發(fā)酵條件研究

劉默洋，唐自鐘，晉海軍，孫　蓉，陳　惠，韓學(xué)易（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014）

共表達(dá)纖維素酶菌株發(fā)酵條件研究

劉默洋，唐自鐘，晉海軍，孫蓉，陳惠*，韓學(xué)易
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014）

目的：為了解決在發(fā)酵過程中酶活較低、成本高等問題，加快纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)。方法：采用Plackett-Burman進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響基因工程菌pET30b-BGL產(chǎn)酶因素：接種量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、裝液量（C），誘導(dǎo)時(shí)間（D）、初始pH（E）、IPTG誘導(dǎo)濃度（F）進(jìn)行篩選，進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、初始pH和裝液量對(duì)產(chǎn)酶有重要影響。進(jìn)一步用Box-Behnken的響應(yīng)面方法，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果：當(dāng)溫度為35℃，初始pH7.5，裝液量為25mL（容積為100mL），pET30b-BGL產(chǎn)酶的酶活最高達(dá)到2080.5U/mL，較優(yōu)化前的1196.8U/mL提高了將近一倍。結(jié)論：本研究為進(jìn)一步研究纖維素酶提供了依據(jù)。

纖維素酶，大腸桿菌，發(fā)酵條件，響應(yīng)面分析法

植物細(xì)胞壁主要是由纖維素構(gòu)成的，由光合作用產(chǎn)生的植物纖維素物質(zhì)是自然界中含量最豐富的碳水化合物之一，是一類可再生的重要資源和能源［1］。纖維素水解成可利用的葡萄糖，具有很大的難度，利用纖維素酶、實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化與利用，對(duì)于解決目前世界存在的能源、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有非常現(xiàn)實(shí)和重要的意義［2-3］。纖維素酶有外切葡聚糖酶（exoglucanase）、內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）和β葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosiase）3種酶組成的復(fù)合酶，它能夠降解纖維素，使其生成纖維二糖、葡萄糖［4-7］。目前纖維素酶的酶活較低、生產(chǎn)成本過高，嚴(yán)重限制了纖維素酶的大規(guī)?；a(chǎn)和實(shí)際生活中的應(yīng)用。因此，纖維素酶的研究和應(yīng)用成為目前國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室已將2種纖維素酶：內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶同時(shí)表達(dá)于同一大腸桿菌并具有高酶活的工程菌株pET30b-BGL出發(fā)［8-10］，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化工程菌產(chǎn)酶條件，提高產(chǎn)酶水平。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖、β-葡萄糖苷酶的重組基因工程菌pET30b-BGL為本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并成功表達(dá)；氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan） 均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；IPTG為美國AMRESCO公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、結(jié)晶酚、NaCl、NaOH、CMC-Na、K2HPO4·3H2O，KH2PO4等均為國產(chǎn)分析純。

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)Thermo；離心機(jī)Eppendorf，Centrifuge 5417R，Germany；Eppendor微量加樣器（0.5～10μL）；Finnpipette微量加樣器（40～200μL）；QL-901型旋渦混合器江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；SW-CJ-U型凈化工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；98-2-B磁力攪拌電熱套天津市泰斯特儀器有限公司；Unico2102C-紫外可見分光光度計(jì)上海尤尼可有限公司儀；DK-8D型電熱恒溫水槽上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F型全溫振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-S型電熱恒溫水浴鍋江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2培養(yǎng)基和試劑的配制

1.2.1LB培養(yǎng)基1%胰蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉，pH7.0～7.5；配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加入1.5～2.0%的瓊脂粉。

1.2.2LB-Amp-Kan培養(yǎng)基自LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入100μg/mL的氨芐青霉素鈉和50μg/mL硫酸卡納霉素。

1.2.33，5-二硝基水楊酸試劑（DNS） 稱取3，5-二硝基水楊酸6.3g，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，然后加入2mol/L氫氧化鈉溶液262mL，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，加熱攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯存于棕色瓶中，室溫放置一周后即可使用。

1.2.41%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液稱取1g羧甲基纖維素鈉，放入100mL 1/15mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液（pH6.8）中，加熱溶解，補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分，置于4℃保存。

1.2.5IPTG誘導(dǎo)溶液在8mL蒸餾水中溶解2g IPTG后，用蒸餾水定容至10mL，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成1mL小份貯存于-20℃。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1搖瓶培養(yǎng)方法從平板上挑取一環(huán)工程菌pET30b-BGL接種于10mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h后取出作為液體種子。按3%接種量接種到LB培養(yǎng)基（含100μg/mL Amp和50μg/mL Kan），每隔12h加入IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

1.2.2Plackett-Burman篩選影響工程菌pET30b-BGL產(chǎn)酶的重要因素以培養(yǎng)條件中的6個(gè)因素為研究對(duì)象，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取2水平，N=12的P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶活為響應(yīng)值（表1），使用Design-Expert V8.0.6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，篩選對(duì)產(chǎn)酶有重要影響的顯著因子。

表1　P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表Table 1　Factors and levels for P-B experiment

1.2.3Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)P-B實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果，影響酶活最主要的3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的B-B設(shè)計(jì)（表2）。使用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表2　實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 2　Levels and coding of experiment

1.2.4纖維素酶酶活力測(cè)定方法以1mL 1%的羧甲基纖維素鈉（用1/15mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液配制）為底物，加入0.1mL粗酶液，50℃水浴反應(yīng)30min后，加入2.5mL DNS顯色液，沸水浴煮10min，取出后在流水下迅速冷卻后定容至5.0mL搖勻。將滅活的酶液作為空白對(duì)照，其他同以上步驟。在530.0nm波長處測(cè)得各管溶液的吸光值［11-13］。

酶活的定義：1g酶液每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖的酶量作為1個(gè)酶活單位，用μ/g表示。酶活性的計(jì)算公式：

式中，U（μ/g）為試樣中纖維素酶活性；C（μg/mL）為根據(jù)試樣吸光度由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出葡萄糖量；V為浸提試樣時(shí)所加入的緩沖液體積（mL）；F為試樣反應(yīng)前的稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.5數(shù)據(jù)處理采用軟件Design-Expert V8.0.6.1。

2　結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響產(chǎn)酶的重要因素

微生物在生長代謝過程中，培養(yǎng)環(huán)境的變化對(duì)其生長和代謝產(chǎn)物的分泌都會(huì)產(chǎn)生影響。以接種量（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、裝液量（X3）、誘導(dǎo)時(shí)間（X4）、初始pH（X5）、IPTG誘導(dǎo)濃度（X6）這6個(gè)因素為研究對(duì)象，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取2水平，N=12的P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3），以纖維素酶酶活為響應(yīng)值篩選顯著因子。

表3　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和酶活Table 3　Activity of reconstructed enzyme and experiment design of P-B

結(jié)果分析（表4），初始pH、裝液量和培養(yǎng)溫度這3個(gè)因素的可信度均在96%以上，對(duì)酶活有顯著影響。模型的擬合度R2為99.82%，且與校正擬合度一致；信噪比為32.398，遠(yuǎn)大于4，說明該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值。

表4P-B顯著性分析Table 4　Significance analysis for P-B

2.2響應(yīng)面分析確定最適產(chǎn)酶條件

使用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)P-B實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果，影響酶活最主要的3個(gè)因素培養(yǎng)溫度、初始pH和裝液量進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析。各因素的低水平（-1）為P-B設(shè)計(jì)中的低水平，高水平（1）為P-B設(shè)計(jì)中的高水平，中間水平（0）為（-1）和（1）的平均值，其余因素均取其低水平（表5）。

表5　B-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和酶活結(jié)果Table 5　Activity of enzyme and expriment design of B-B resuts

使用Design-Expert V8.0.6.1軟件，對(duì)表3中得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用響應(yīng)面軟件進(jìn)行方差分析。

表6　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析Table 6　Analysis of variance of B-B

結(jié)果可知（表6），構(gòu)建的模型的Pr＞F值遠(yuǎn)小于0.01，說明該模型極顯著；失擬項(xiàng)的Pr＞F值為0.1810，無顯著意義，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中無異常點(diǎn)，無需引入更高次項(xiàng)，模型可行。另外，模型的校正擬合度R2= 98.09%，變異系數(shù)C.V.=10.69%，信噪比為14.71，表明該模型可以用于解釋實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果。

以酶活為響應(yīng)值，根據(jù)表5和表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對(duì)模型進(jìn)行二次回歸分析，尋求酶活最大值及相應(yīng)的對(duì)酶活有影響的因素的水平，得到回歸方程：酶活=1956.80+497.63A+ 403.00B+97.88C+77.00AB+214.75AC-136.50BC-491.03A2-222.28B2-270.03C2，通過對(duì)回歸方程分析，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃，初始pH7.5，裝液量為25mL（容積為100mL），工程菌pET30b-BGL產(chǎn)酶的酶活最高為2000U/mL。為驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)值，在該條件下，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得的酶活為2080.5U/mL，與預(yù)測(cè)值接近，比沒有優(yōu)化前的1196.8U/mL提高了將近一倍。

2.3因素間的交互作用分析

根據(jù)回歸方程作出的響應(yīng)面圖見圖1～圖3。響應(yīng)面圖可直觀反映各因子之間的交互作用強(qiáng)弱，橢圓表示兩因子交互作用明顯，圓形則表示交互作用較小或沒有交互作用。由圖可知，在各因子的最佳值情況下模型有最大值，且各因子相互之間有或強(qiáng)或弱的交互作用，培養(yǎng)溫度和裝液量交互影響很明顯，而培養(yǎng)溫度和初始pH、初始pH和裝液量之間交互作用很小。

圖1　溫度與初始pH交互影響酶活的響應(yīng)面圖Fig.1　Response surface plot of the combined effects of temperature and initial pH on the activity of enzyme

圖2　溫度與裝液量交互影響酶活的響應(yīng)面圖Fig.2　Response surface plot of the combined effects of temperature and the volume of liquid on the activity of enzyme

3　討論

由于原始菌株產(chǎn)酶能力低，酶活不高，通過基因重組技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行改良，培養(yǎng)后能提高產(chǎn)酶能力，降低生產(chǎn)成本?；蚬こ叹呙芏劝l(fā)酵產(chǎn)品，在食品、環(huán)保和醫(yī)藥等方面都有很大的應(yīng)用價(jià)值。大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝被廣泛的應(yīng)用于在重組蛋白的生產(chǎn)［14］。發(fā)酵過程中產(chǎn)量的多少主要取決于工程菌的細(xì)胞密度，目的蛋白的表達(dá)量［12］。為工程菌提供良好的生長條件、減少對(duì)細(xì)胞生長有毒害作用和抑制目的蛋白表達(dá)的物質(zhì)，可以提高目的蛋白的表達(dá)量。因此，通過對(duì)工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，可以使其酶活進(jìn)一步得到提高，比如溫度、pH、通氣量、接種量、誘導(dǎo)劑等因素。2005年，胡彩靜等對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌株里氏木霉ZU-03產(chǎn)纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，酶活力提高近3倍［15］；2008年，潘春梅等借助響應(yīng)面法分析，對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌康氏木霉P12進(jìn)行了發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化研究，優(yōu)化條件過后纖維素酶活提高了96.7%［16］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化過后，比沒有優(yōu)化前酶活提高將近一倍，為以后能在小型發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，提供初始參考數(shù)據(jù)，為以后能大規(guī)模發(fā)酵并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)奠定一定的基礎(chǔ)。

圖3　初始pH與裝液量交互影響酶活的響應(yīng)面圖Fig.3　Response surface plot of the combined effects of Initial pH and the volume of liquid on the activity of enzyme

4　結(jié)論

利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)接種量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、裝液量（C）、誘導(dǎo)時(shí)間（D）、初始pH（E）、IPTG誘導(dǎo)濃度（F）6個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，方差分析結(jié)果表明，影響工程菌pET30b-BGL II產(chǎn)酶的主要因素有培養(yǎng)溫度、初始pH和裝液量；在此基礎(chǔ)上，用Box-Behnken的響應(yīng)面分析對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)溫度為35℃，初始pH7.5，裝液量為25mL（容積為100mL）酶活最高為2080.5U/mL，較優(yōu)化前的1196.8U/mL提高了將近一倍，為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Kubicek CP，Messner R，Gruber F，et al.The Trichoderma cellulase regulatory puzzle：From the interior life of a secretory fungus［J］.Enzyme and Microbial Technology，1993，15（2）：90-99.

［2］Zhang YHP，Himmel M，Mielenz JR.Outlook for cellulase improvement：screening and selection strategies［J］.Biotechnology Advances，2006，24：452-481.

［3］趙榮樂.纖維素酶研究進(jìn)展［J］.喀什師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26（6）：51-54.

［4］Warren RAJ.Microbial hydrolysis of polysaccharides［J］. Annual Review of Microbiology，1996，50：1167-1178.

［5］Teeri TT.Crystalline cellulose degradation：new insight into the function of cellobiohydrolases［J］.Trends Biotechnol，1997，15：160-167.

［6］WithersSG.Mechanismsofglycosyltransferasesand hydrolyses［J］.Carbohydr Polym，2001，44：325-337.

［7］Eriksson KEL，Blanchette RA，Ander P.Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components［M］. Springer-Verlag，New York，1990.

［8］耿風(fēng)廷，趙曉瑜，高珊.多基因在大腸桿菌中的共表達(dá)策略［J］.生物技術(shù)通訊，2007，39（3）：27-33.

［9］唐自鐘，劉姍，韓學(xué)易，等.重組β-葡萄糖苷酶基因和內(nèi)切葡聚糖苷酶基因在大腸桿菌中的共表達(dá)［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（24）：189-194.

［10］Tang ZZ，Chen H，Chen LJ，et al.Improving endoglucanase activity by adding the carbohydrate-binding module from corticium rolfsii［J］.J Microbiol Biotechnol，2014，24（4）：440-446.

［11］Tolonen AC，Chilaka AC，Church GM.Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367［J］.Mol Microbiol，2009，74（6）：1300-1313.

［12］Cai GH，Zhang Z，Wang ZH.Fusion expression and analysis of the epitopes in tartary buckwheat allergen［J］.Food Science，2006，11：211-215.

［13］Tang ZZ，Wu ZF，Chen H，et al.Characterization of novel EGs reconstructed from Bacillus subtilisendoglucanase［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology，2013，169：1764-1773.

［14］Fuchs C，Koster D，Wiebusch S，et al.Scale-up of dialysis fermentation for high cell density cultivation of Escherichia coli［J］.Journal of Biotechnology，2002，93（3）：243-251.

［15］胡彩靜，代淑梅，李秋園.里氏木霉產(chǎn)纖維素酶液態(tài)發(fā)酵條件的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（9）：45-48.

［16］潘春梅，王輝，任敏.纖維素酶液體發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析優(yōu)化［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008，31（8）：120-124.

Study on fermentation conditions of co-expression cellulase strains

LIU Mo-yang，TANG Zi-zhong，JIN Hai-jun，SUN Rong，CHEN Hui*，HAN Xue-yi
（College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Objective：To solve the low enzyme activity and high cost in the process of cellulase fermentation and ameliorate the industrial production.Methods：These factors［Inoculums’quality（A），temperature（B），liquid volume（C），induce time（D），initial pH（E）and IPTG concentrate（F）］were used to screen and analyze by Plackett-Burman.From the results，Box-Behnken analyze was conducted，the temperature（B），liquid volume（C）and initial pH （E）were used to optimized.Results：The enzyme activity of pET30b-BGL had nearly 2-fold increase than before（1196.8U/mL to 2080.5U/mL）in the condition of 35℃，pH7.5 and 25mL liquid volume（100 mL in all）.Conclusion：This research could provide the basis for the further investigations of cellulase.

cellulases；Escherichia coli；fermentation conditions；response surface analysis

Q814

A

1002-0306（2015）02-0173-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.028

2014－04－10

劉默洋（1989-），男，在讀碩士研究生，主要從事微生物酶工程及蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究。

陳惠（1962-），女，博士，教授，主要從事微生物酶工程方面的研究。