響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝

于金躍，孫　晶，李新華，齊曉軍，王海娜

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161）

響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝

于金躍，孫晶，李新華*，齊曉軍，王海娜

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110161）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊莖中黃酮類物質(zhì)的提取工藝。分別研究提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)水飛薊莖中總黃酮提取量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝為提取時(shí)間50min、提取溫度61℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶40。該條件下水飛薊莖中總黃酮提取量為4.71mg/g，與多項(xiàng)式回歸模型的結(jié)果一致。

水飛薊莖，總黃酮，響應(yīng)面法，提取工藝

黃酮類化合物是植物產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］，廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中。黃酮類化合物具有高度的化學(xué)反應(yīng)性，如能清除體內(nèi)的自由基，具有抗氧化性作用［2］；且黃酮類化合物擁有抑制酶的活性、抗病毒［3］、抗炎癥［4］、抗癌［5］、抗糖尿病并發(fā)癥［6］等功能，已被列為保健食品的一類功能因子［7］。

水飛薊（Silybum marianum）是一種一年生或兩年生植物，原產(chǎn)于南歐及北非［8］，被稱為具有抗癌活性的草藥［9］，同時(shí)有益于肝臟疾?。?0］和免疫系統(tǒng)疾病的治療［11］。目前，水飛薊已成為世界公認(rèn)的保肝植物。但目前大多是對(duì)水飛薊種籽進(jìn)行研究，而對(duì)水飛薊莖葉的研究相對(duì)較少［12］。本研究以水飛薊莖為原料，采用有機(jī)溶劑提取水飛薊莖中黃酮類物質(zhì)，以總黃酮提取量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊莖中黃酮類物質(zhì)的提取工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用水飛薊莖葉提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

水飛薊莖采自遼寧盤錦，自然風(fēng)干；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%） 成都曼斯特有限公司；無(wú)水乙醇沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠。

GD200-2型電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHE-IIIB型循環(huán)水式多用真空泵上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；7200型可見分光光度計(jì)尤尼柯（上海）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用60%的乙醇定容至100m L的容量瓶中，配制成0.1mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)液。

分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10m L試管中，加60%的乙醇溶液至5m L。加5%的NaNO2溶液0.3m L，搖勻后靜置5m in；加10%的A l（NO3）3溶液0.3m L，搖勻后靜置6m in；加4%的NaOH溶液4m L，用60%的乙醇溶液定容至10m L，搖勻后靜置15m in，于506nm處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（mg/m L）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］。

1.2.2水飛薊莖中總黃酮含量的測(cè)定方法將風(fēng)干的水飛薊莖打碎成粉末，過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱取1.00g水飛薊莖粉末于錐形瓶中，在一定的溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取一定時(shí)間后，抽濾；濾液用乙醇溶液定容至100m L的容量瓶中，搖勻，作為待測(cè)液；移取1.00m L待測(cè)液按1.2.1方法于506nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程，用吸光度計(jì)算出被測(cè)液中黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度c，然后由c計(jì)算出水飛薊莖中總黃酮的含量。

式中：c-稀釋后樣品溶液總黃酮質(zhì)量濃度（mg/ m L）；N-稀釋倍數(shù)：10；V-最初樣品定容體積（100m L）；m-樣品質(zhì)量（1.00g）。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響準(zhǔn)確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，料液比為1∶40，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液分別在40、50、60、70、80℃條件下回流提取50m in。

1.2.3.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響準(zhǔn)確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，料液比為1∶40，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液，在60℃條件下回流提取50min。

1.2.3.3料液比對(duì)總黃酮提取量的影響準(zhǔn)確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，分別加入料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的60%乙醇在60℃條件下回流提取50m in。

1.2.3.4提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響準(zhǔn)確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，料液比為1∶40，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液在60℃條件下分別提取10、30、50、70、90m in。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度為對(duì)提取黃酮影響較顯著的三個(gè)因素，在固定提取時(shí)間50m in的條件下，根據(jù)Box-Beknhen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以黃酮提取量為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定水飛薊莖中總黃酮提取的最佳工藝。因素水平編碼表如表1所示。

表1　響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1　Factors and levers of response surface test

1.2.5數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)中所用到的數(shù)據(jù)分析軟件是Design Expert.v 8.0和Spass Statistics 17.0。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

蘆丁線性回歸方程為：y=12.314x-0.0006，R2= 0.9996，在0～0.005mg/m L濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

2.2影響總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響不同提取溫度對(duì)水飛薊莖中總黃酮提取量影響的結(jié)果如圖2所示。

圖2　提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on total flavonoids yield

由圖2可知，當(dāng)提取的溫度低于60℃時(shí)，隨著溫度的升高，黃酮的提取量增加；當(dāng)溫度為60℃時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最大，但當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，黃酮提取量反而下降。原因是溫度升高接近乙醇沸點(diǎn)有利于回流，提取量會(huì)增加，但是溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致活性成分的破壞從而使黃酮的提取量下降［14］。

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)水飛薊莖中總黃酮提取量的影響見圖3。

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，水飛薊莖中黃酮的提取量逐漸增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，黃酮的提取量最高。超過(guò)該體積分?jǐn)?shù)后，黃酮的提取量反而下降，同時(shí)葉綠色大部分溶出，通過(guò)用比色法來(lái)測(cè)定黃酮含量的結(jié)果帶來(lái)一定的影響，所以選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%左右比較適宜。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2.3料液比對(duì)總黃酮提取量的影響不同料液比對(duì)水飛薊莖中總黃酮提取量影響的結(jié)果如圖4所示。

圖4　料液比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.4　Effectof liquid-to-solid ratio on total flavonoids yield

由圖4可知，隨著料液比的增加，黃酮提取量逐漸增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時(shí)，黃酮的提取量達(dá)到最大，當(dāng)料液比超過(guò)1∶40時(shí)，黃酮的提取量逐漸下降且趨于平緩。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響不同提取時(shí)間對(duì)水飛薊莖中總黃酮提取量的影響見圖5。

圖5　提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.5　Effectof extraction time on total flavonoids yield

由圖5可知，隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮提取量增加，當(dāng)浸提時(shí)間是50m in時(shí)，黃酮提取量最高，達(dá)到4.60mg/g。繼續(xù)延長(zhǎng)浸提的時(shí)間，黃酮提取量有所下降。可能是由于回流熱效應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)破壞黃酮，使其損失增大而影響黃酮的提取量從而產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，利用Design Expert.v 8.0軟件進(jìn)行回歸分析，得到水飛薊莖中黃酮提取量（Y）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Test design and results of response surface analysis

2.3.2回歸方程方差分析方差分析結(jié)果詳見表3所示，模型Prob＞F值小于0.01，表明該回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，同時(shí)B、BC、A2、B2、C2對(duì)黃酮提取量Y值的影響極顯著。從表3中可以看出，在所選取的因素中，對(duì)黃酮提取量的影響大小依次為：料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度，并且模型的決定系數(shù)R2= 99.31%，大于90%，說(shuō)明模型方程擬合程度好，可以用于黃酮提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

2.3.3響應(yīng)曲面分析根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面圖，見圖6～圖8。

圖6　乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface plot showing the interactive effectof ethanol concentration and material-liquid ratio on total flavonoids yield

從圖6中可以看出，等高線的形狀為偏圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)A和料液比B交互作用不顯著。響應(yīng)曲面較為陡峭，響應(yīng)值隨料液比B的變化率大于乙醇體積分?jǐn)?shù)A的變化率，說(shuō)明在兩者的交互作用中料液比B對(duì)水飛薊莖中總黃酮含量的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)A。

表3　方差分析表Table 3　Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

從圖7中可以看出，等高線的形狀偏圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)A和提取溫度C的交互作用不顯著。響應(yīng)曲面較為平滑，響應(yīng)值隨乙醇體積分?jǐn)?shù)A的變化率大于提取溫度C的變化率，說(shuō)明在兩者的交互作用中乙醇體積分?jǐn)?shù)A對(duì)水飛薊莖中黃酮的含量的影響大于提取溫度C。

圖7　提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface plot t showing the interactive effectof extraction temperature and ethanol concentration on total flavonoids yield

從圖8可以看出，等高線的形狀為橢圓形，表明料液比B和提取溫度C的交互作用極顯著，即水飛薊莖中黃酮含量受料液比B和提取溫度C的交互作用顯著。響應(yīng)曲面較為陡峭，響應(yīng)值隨料液比B的變化率大于提取溫度C的變化率，說(shuō)明在兩者的交互作用中料液比B對(duì)水飛薊莖中黃酮的含量的影響大于提取溫度C。

圖8　提取溫度和料液比對(duì)總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface plot showing the interactive effectof extraction temperature and material-liquid ratio on total flavonoids yield

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化提取水飛薊莖中總黃酮的工藝，得到的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)39.35%，料液比1∶40.09，提取溫度61.04℃。結(jié)合實(shí)際情況并加以修正最終確定以乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶40，提取溫度61℃為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的最佳工藝條件。進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到總黃酮的實(shí)際平均提取量為4.71mg/g，與理論值4.72mg/g接近。由此可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇合理。

3　結(jié)論與討論

首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)水飛薊莖中總黃酮提取量的影響，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝，得到水飛薊莖中總黃酮提取的最佳工藝為：提取時(shí)間50min、提取溫度61℃、料液比1∶40、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%。此條件下，水飛薊莖中總黃酮的提取量達(dá)到4.71mg/g。

水飛薊莖中含有較高的總黃酮，是否能分離出水飛薊素，是否具有與水飛薊種子中黃酮相似的藥用和保健功能，還有必要做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。由于黃酮類物質(zhì)都在一定程度上具有保健功能，因此，水飛薊莖的開發(fā)利用將是水飛薊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新途徑。

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Optim ization extraction of total flavonoids from stem s of Silybum marianum by response surface methodology

YU Jin-yue，SUN Jing，LIXin-hua*，QIXiao-jun，WANG Hai-na
（Food College of Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

The flavonoids from stem s of Silybum marianum were extracted w ith ethanol，and the extraction p rocess was op tim ized by response surface methodology，four sing le factors testwere made to investigate the effects of extraction time，ethanol concentration，material-liquid ratio on total flavonoids yield.The research findings showed that the op tim ized cond itions were as follows：extraction time 50m in，extraction tem perature 61℃，ethanol concentration 40%，material-liquid ratio 1∶40.Under the cond itions，the yield of flavonoids was 4.71g/mg w ith results of a polynom ial regressionmodelwere in ag reement.

stem s of Silybum marianum；total flavonoids；response surface methodology；extraction p rocess

TS202.3

B

1002-0306（2015）06-0295-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.056

2014-06-17

于金躍（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

李新華（1955-），男，碩士，教授，研究方向：糧食加工與轉(zhuǎn)化。