響應面法優(yōu)化閃式提取杜香熊果酸及熊果酸性質研究

張喬會，逄錦慧，崔　潔，趙巧嬌，李建霞，王建中，*

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083；2.北京林業(yè)大學材料科學與技術學院，林木生物質化學北京市重點實驗室，北京100083）

響應面法優(yōu)化閃式提取杜香熊果酸及熊果酸性質研究

張喬會1，逄錦慧2，崔潔1，趙巧嬌1，李建霞1，王建中1，*

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083；2.北京林業(yè)大學材料科學與技術學院，林木生物質化學北京市重點實驗室，北京100083）

以杜香為原料，采取閃式提取輔助提取熊果酸，在單因素實驗的基礎上，對提取工藝進行響應面優(yōu)化，最終得到優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為：閃式提取3min，提取溫度為90℃，乙醇濃度為84%，料液比為1∶25，在此條件下實際測得的平均提取得率為1.52%。分析發(fā)現(xiàn)樣品與標準品的紅外吸收峰基本一致，樣品含有熊果酸的典型基團。提取的杜香熊果酸在300～390℃溫度范圍內發(fā)生熱解反應，失重率達70%以上。杜香熊果酸結晶度為64.3%，與熊果酸標準品基本一致。利用電鏡掃描觀察杜香熊果酸樣品，發(fā)現(xiàn)其基本呈橢球形均勻分布。

杜香，熊果酸，閃式提取，響應面，熱重，X-RD

杜香（Ledum palustre L.）為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木［1］，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%［2］。大興安嶺杜香干葉年生產量達536925t·a-1［3］，小興安嶺杜香的蘊藏量可達8776.7t·hm-2·a-1，其中允收量以鮮重計為1843.2t·hm-2·a-1［3］。杜香枝葉含有多種揮發(fā)性物質、熊果酸、多糖、黃酮等成分［4-7］。

熊果酸又名烏索酸，能溶于醇，不溶于水、石油醚等，具有抗氧化［8］、鎮(zhèn)靜、增強機體免疫力、保肝［9-10］、抗癌、抗腫瘤［11-16］、美白、抗菌等藥理作用。目前其提取方法主要有乙醇熱提法、甲醇滲漉法、超臨界提取、回流提取法，并輔助超聲波［17］、微波提取等。閃式提取法提取速度快、效率高，但少見將其用于杜香熊果酸提取的報道。從植物中提取熊果酸的研究，目前報道的主要有從枇杷葉［18］、山楂［19］、南蛇藤［20］、山茱萸［21］、薔薇等植物中提取。杜香資源量大，熊果酸價值高，因此，優(yōu)化杜香熊果酸的閃式提取工藝及研究其性質對開發(fā)利用杜香熊果酸具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

杜香由內蒙古金河林業(yè)局2013年7月中旬采集提供，由北京林業(yè)大學植物專家鑒定為杜香；無水乙醇、石油醚AR，天津光復精細化工研究所；去離子水、活性碳；熊果酸標準品HPLC≥98%，中國食品藥品檢定研究所。

Tensor27型FT-IR紅外光譜儀德國Bruker公司；JHBE-50S型閃式提取控制器鄭州金星科技有限公司；HHS4型恒溫水浴鍋上海浦東躍新科學儀器廠；KQ-500E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；QI-901型渦旋混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司；臺式離心機上海安亭科學儀器廠；RE-5203型旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；METTLER TOLEDO型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1型冷凍干燥機北京德天佑科技發(fā)展有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡、E-1010型濺射鍍膜機日本日立公司；TGA 60型熱重分析儀、XRD-6000型x射線衍射儀日本Shimadzu公司。

1.2實驗方法

1.2.1試樣的制備將杜香枝葉切分成2～3cm的小段后于40℃烘箱中烘干，然后用BL-05粉碎機粉碎，過80目篩，將過篩后的粉末按1∶5加入石油醚脫脂脫色12h，過濾除去石油醚并將粉末放入40℃烘箱中烘干，然后存于室內陰涼干燥處備用。

1.2.2杜香中熊果酸的提取工藝采用高效的閃式提取法輔助提取，用乙醇溶液作提取劑，回收溶劑并用石油醚和水除雜，用活性碳脫色，并置于冷凍干機中干燥。

1.2.3熊果酸粗提物得率計算按以下公式計算提取得率：

式中：P—熊果酸粗提物提取得率；m—提取得到的杜香熊果酸學浸膏的干重；W—杜香粉末的重量。

1.2.4杜香熊果酸提取的單因素實驗設計分別以不同的提取溫度、閃式提取時間、提取液濃度及液料比為單因素，考察各因素對杜香熊果酸提取得率的影響。

1.2.4.1閃式提取時間設定乙醇濃度為90%，料液比1∶20，提取溫度為室溫（約20℃），考察閃式提取時間分別為1、2、3、4、5m in時對杜香熊果酸提取得率的影響。

1.2.4.2乙醇濃度設定料液比1∶20，提取溫度為室溫（約20℃），閃式提取時間為2m in，考察乙醇濃度分別為80%、85%、90%、95%、100%時對杜香熊果酸提取得率的影響。

1.2.4.3提取溫度設定乙醇濃度為90%，料液比1∶20，閃式提取時間2m in，考察提取溫度分別為20、40、60、80、100℃時對杜香熊果酸提取得率的影響。

1.2.4.4料液比設定乙醇濃度為90%，提取溫度室溫（約20℃），閃式提取時間2m in，考察料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（m/v）時對杜香熊果酸提取得率的影響。

1.2.5杜香熊果酸提取工藝的響應面實驗設計在單因素實驗的基礎上，運用Design Expert 7.1軟件程序，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理［5，15］，采用四因素三水平的響應面分析法，以提取溫度（A）、閃式提取時間（B）、料液比（C）、提取液濃度（D）為自變量，以杜香熊果酸浸膏的提取得率為響應值，通過響應曲面分析（response surface analysis，RSA）對提取條件進行優(yōu)化。

表1　響應面實驗因素水平設計表Table 1　Analytical factors and levels for RSA

1.3熊果酸的性質測定

1.3.1杜香熊果酸的紅外檢測取少量干燥后的樣品，利用Tensor27型FT-IR紅外光譜儀對杜香熊果酸樣品及熊果酸標準品進行紅外測定，紅外測定范圍為400～4000cm-1，分辨率為2cm-1。并對標準品和樣品的光譜結果進行比對鑒定。

1.3.2杜香中提取的熊果酸的表觀性質分析在掃描電子顯微鏡（SEM）設備下觀察冷凍干燥后的杜香熊果酸的表面形態(tài)，掃描電鏡采用10kV的加速電壓，檢測前，使用濺射鍍膜機對材料表面進行噴金。

1.3.3杜香中提取的熊果酸的熱穩(wěn)定性分析準確稱取少量的杜香熊果酸樣品及熊果酸標準品（3～8mg），放入綜合熱重分析儀在20～800℃溫度范圍內對杜香熊果酸進行熱綜合（TG/DTG）分析測定，以考察杜香熊果酸的熱穩(wěn)定性。分析條件：掃描溫度為20～800℃，升溫速度為10℃/m in，N2流速為40m L/m in。

1.3.4杜香中提取的熊果酸的結晶性況分析取一定量的水提杜香熊果酸于X射線衍射儀的樣品室內進行掃描，掃描范圍為5～60°，在的掃描范圍內5°/min的變化速率進行X射線照射，利用得到的數(shù)據(jù)繪制XRD衍射強度曲線圖，并計算出樣品的結晶度。根據(jù)衍射角與衍射強度的關系繪制XRD曲線。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel（Office 2007）軟件整理數(shù)據(jù)，Design Expert 7.1、SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1杜香熊果酸提取單因素實驗結果

2.1.1閃提時間對杜香熊果酸浸膏提取得率的影響

從圖1可以看出，隨著提取時間的增加，熊果酸提取得率逐漸增大，在提取時間為1～3m in，隨著時間的增加，提取得率呈正相關增長，此后再增加提取時間，提取得率變化不大。前期時呈正相關增長可能是因為閃式提取的高剪切作用使得產物從物料中快速溶出，而隨著時間的增加，產物大部分被提取，再增加閃提時間對提取已無輔助作用，從而使得提取得率基本無變化。利用軟件進行LSD分析可知，提取3min與提取1、2m in比較差異顯著（p＜0.01），與提取4、5m in比較差異不顯著（p＞0.05），所以選擇提取3min。

圖1　時間對杜香熊果酸提取得率的影響Fig.1　Effectof time on extraction yield of Ledum palustre L. Ursolic Acid

2.1.2乙醇濃度對杜香熊果酸浸膏提取得率的影響

從圖2看出，隨著乙醇濃度的增加提取得率逐漸增大，當乙醇濃度為80%時，杜香熊果酸浸膏提取得率達到最大值，此后隨著乙醇體積分數(shù)的增加熊果酸得率逐漸下降，可能是因為80%乙醇提取劑的極性能保證熊果酸有最好的溶解度，偏離最佳溶解度時提取得率會有所下降。因此確定乙醇體積分數(shù)最佳為80%。通過LSD分析，各水平間差異極顯著（p＜0.01），所以乙醇濃度選80%可靠。

圖2　乙醇濃度對杜香熊果酸提取得率的影響Fig.2　Effectof ethanol concentration on extraction yield of Ledum palustre L.Ursolic Acid

2.1.3提取溫度對杜香熊果酸浸膏提取得率的影響

從圖3可以看出，溫度的高低對熊果酸的提取有較大的影響，在100℃內變化提取溫度，提取得率與溫度關系曲線呈典型的饅頭峰。隨著溫度的升高，提取得率增大，當溫度達到80℃時提取得率達到最大，之后明顯下降。通過LSD分析，各水平間差異極顯著（p＜0.01），所以選擇80℃可靠。

圖3　溫度對杜香熊果酸提取得率的影響Fig.3　Effectof temperature on extraction yield of Ledum palustre L.Ursolic Acid

2.1.4料液比對杜香熊果酸浸膏提取得率影響從圖4看出，在料液比從1∶15增加到1∶30時，杜香熊果酸提取得率穩(wěn)步上升，可能是因為隨著料液比增大，目標提取物會更易溶于提取溶劑中，但隨著料液比達到1∶25后，提取得率增加幅度減弱，幾乎不增加，可能是因為一定比例的溶劑已經將有效成分溶出完全，再加大料液比也無產物可以溶出，因此選擇1∶25作為最佳料液比。通過LSD分析可知，各水平之間差異不顯著（p＞0.05），所以從提取得率及環(huán)保角度考慮選擇1∶25。

圖4　料液比對杜香熊果酸提取得率的影響Fig.4　Effectof ratio of rawmaterial towater on extraction yield of Ledum palustre L.Ursolic Acid

2.2杜香熊果酸提取響應面實驗結果

2.2.1響應面模型回歸分析以A（提取時間）、B（提取溫度）、C（乙醇濃度）、D（料液比）為變量，以杜香熊果酸浸膏的提取得率為響應值，按響應面軟件Design Expert 7.1提供設計的組合進行實驗，得到結果見表2。

采用Design Expert 7.1軟件程序對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出杜香熊果酸提取得率的回歸方程如下：Y=1.38+0.074A+0.038B+0.23C+0.058D+0.022AB+ 0.040AC+5.000E-003AD+5.000E-003BC+0.022BD+0.050CD-0.057A2-0.011B2-0.20C2-0.050D2

表2　響應面分析的實驗結果Table 2　Program and experimental results of RSA

其決定系數(shù)R2=0.9947，說明回歸方程適用于提取杜香熊果酸的理論預測值。對回歸方程做顯著性檢驗與方差分析，結果見表3。

表3　二次響應面回歸模型方差分析Table 3　ANOVA for response surface quadraticmodel analysis of variance table

2.2.2響應面圖形分析根據(jù)回歸方程，作出響應面和等高線圖，考察擬合響應曲面的形狀，閃式提取時間、提取溫度、料液比和提取液濃度對杜香熊果酸提取得率的影響，如圖5所示，等高線的形狀可以反映出交互相的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由二次響應面回歸模型方差分析及響應面圖形及結合單因素分析可知，乙醇濃度對提取得率的影響最為明顯，各因素兩兩之間交互作用比較明顯，閃式提取時間和提取液濃度對得率的交互作用尤其明顯，溫度和提取液濃度、醇濃度及料液比之間的交互作用也十分明顯。從側面說明模型交互作用顯著，實用可靠。

2.2.3優(yōu)化提取工藝條件的確定為進一步確定最佳點，利用Design Expert 7.1軟件程序對工藝條件進行優(yōu)化，可得杜香熊果酸提取得率的最佳工藝參數(shù)為：閃式提取3min，提取溫度為90℃，乙醇濃度為83.49%，料液比為1∶25（g/m L）。在此工藝條件下，軟件程序對杜香熊果酸提取得率的預測值為1.54%。為了實際的操作方便，將杜香熊果酸的提取工藝參數(shù)修正為：閃式提取3min，提取溫度為90℃，乙醇濃度為84%，料液比為1∶25（g/m L），在此條件下實際測得的平均提取得率為1.52%，與理論預測值相近，因此采用修正后的方法得到的提取參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

2.3杜香熊果酸性質測定結果與分析

2.3.1杜香中提取熊果酸的紫外及紅外檢測結果從圖6可以看出，從杜香枝葉中提取得到的樣品紅外吸收與熊果酸標準品的紅外吸收峰基本一致，兩者都在3526.78、2959.40、1717.94、1454.61、1385.57、1244.77cm-1等附近都有明顯有吸收峰，可能為熊果酸中-OH、-C= O、-C-H、-CH3等基團的振動。但兩者的吸收不完全吻合，可能是因為提取物中含有沒有脫除掉的多糖等，從而影響峰值的大小，進而使得兩者不重合。但從吸收波長位置可以說明提取物中含有熊果酸。

圖5　杜香熊果酸提取的響應面分析圖Fig.5　Responsive surfaces on extraction yield of Ledum palustre L.Ursolic Acid

圖6　熊果酸標準品和樣品的紅外光譜圖Fig.6　IR spectrum of Ledum palustre L.Ursolic Acid standard and sample

圖7　杜香中提取的熊果酸樣品的掃描電鏡圖Fig.7　Scanningpictureof Ledum palustre L.Ursolic Acid by SEM

2.3.2電鏡掃描結果從圖7可以看出，杜香熊果酸在放大500倍時沒有固定的形態(tài)，呈現(xiàn)出粉末狀；在放大1500、3000倍時可以看出，杜香熊果酸呈橢球形顆粒狀，且看上去均勻；繼續(xù)放大掃描倍數(shù)至5000、8000、10000倍時，可以看出，三種倍數(shù)下，杜香熊果酸的掃描形態(tài)類似，形狀分布不均勻，為橢球形顆粒與一些不規(guī)則物體的混合體，其中以橢球形顆粒為主，這說明杜香熊果酸的形態(tài)可能是橢球形顆粒，但由于樣品不是純品，其中有一些雜質，導致整個掃描圖呈不規(guī)則形態(tài)，也有可能是由于樣品在粉碎的過程中受機械破壞而引起的樣品損壞。

樣品表面光滑，但有一定的粘附現(xiàn)象，可能是由于樣品間的相互吸引引起，也有可能是樣品與雜質互相吸引。

2.3.3提取物的熱穩(wěn)定性實驗結果在食品加工工程中，常常要用到熱處理，如熱殺菌等過程，而溫度的控制則顯得至關重要，溫度低了，加工效果達不到；溫度高了，可能造成某些物質分解，影響產品性狀、有效成分含量、甚至產生有害物質等。了解某種物質的熱穩(wěn)定性，將會為其熱加工過程提供一定理論基礎。

圖8　杜香熊果酸及熊果酸標準品的熱重分析圖（氮氣保護）Fig.8　TGA analysis of Ledum palustre L.Ursolic Acid and Ursolic Acid standard under N2condition

杜香熊果酸提取物及熊果酸標準品的熱失重結果見圖8。從圖8中殘余率曲線可以看出，300℃以前，熊果酸質量基本沒有變化，說明熊果酸在該溫度范圍內穩(wěn)定；熊果酸標準品的重量變化主要發(fā)生在300～390℃之間，在此溫度范圍內，重量損失明顯，失重率約為98%，說明熊果酸在該溫度范圍內不穩(wěn)定，在熱作用下發(fā)了裂解反應等。從杜香熊果酸樣品的殘余率曲線可以看出，杜香熊果酸樣品的失重曲線與標準品的失重曲線基本一致。但杜香熊果酸樣品的失重溫度范圍更大一些，集中在270～450℃的溫度范圍內，比標準品的失重溫度范圍寬90℃。且當熊果酸的樣品穩(wěn)定后，剩下的成分相對標準品較多，失重率約為90%，這可能是由于得到的杜香熊果酸樣品中含有雜質，且這些雜質中有一部分在300℃以前就不穩(wěn)定，開始失重，有一部分較穩(wěn)定，需要在400～450℃范圍內才能被分解，還有一部分對熱十分穩(wěn)定，在熱作用下不分解或者是已分解的物質灰分多，從而導致最后剩下的物質較多?？傮w來說，杜香熊果酸的失重溫度是300～390℃，失重率約為70%。

2.3.4杜香中提取的熊果酸的結晶度分析從圖9可以看出，杜香熊果酸和熊果酸標準品的X-衍射譜圖趨勢基本一致，各最高峰出現(xiàn)的2θ位置大致在10°～20°之間，且峰形十分銳利，說明結晶度較高。但由杜香熊果酸樣品并非純品，里面含有一定雜質，所以峰形比熊果酸標準品平緩，結晶度相對較低一些，分子剛性也相對差一些。通過對杜香熊果酸樣品及熊果酸標準品的X射線衍射分析表明，杜香熊果酸和熊果酸標準品的結晶度分別為64.3%和68.3%，兩者基本一致。

圖9　杜香熊果酸及熊果酸標準品的X-衍射強度曲線圖Fig.9　XRD intensity curves of Ledum palustre L.Ursolic Acid and Ursolic Acid standard

3　結論

以杜香為原料，采取閃式提取輔助提取熊果酸，在單因素實驗的基礎上，對提取工藝進行響應面優(yōu)化，最終得到優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為：閃式提取3m in，提取溫度為90℃，乙醇濃度為84%，料液比為1∶25（g/m L），在此條件下實際測得的平均提取得率為1.52%。以熊果酸標準品作為對比，對提取樣品進行紅外分析，發(fā)現(xiàn)提取樣品在3526.78、2959.40、1717.94、1454.61、1385.57、1244.77cm-1等附近有明顯吸收峰，分析含有熊果酸中-OH、-C=O、-C-H、-CH3等典型基團的振動。通過熱重分析，提取杜香熊果酸在300～390℃溫度范圍內發(fā)生熱解反應，迅速失重，失重率達70%以上。通過X衍射分析發(fā)現(xiàn)，杜香熊果酸結晶度為64.3%，與熊果酸標準品基本一致。利用電鏡掃描觀察杜香熊果酸樣品，發(fā)現(xiàn)其基本呈橢球形均勻分布。

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Optim ization of extraction conditions of Ursolic Acid from Ledum palustre L.by flash extraction using response surface analysis and properties analysis of Ursolic Acid

ZHANG Qiao-hui1，PANG Jin-hui2，CUI Jie1，ZHAO Qiao-jiao1，LI Jian-xia1，WANG Jian-zhong1，*
（1.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry，College ofMaterials Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

In this study，Ursolic Acid extracted from L.palustre w ith high extrac tion yield was successfully studied by the method of flash extraction.To im p rove the extraction yield of the Ledum Ursolic Acid in this study，a Box-Behnken design was em p loyed based on four fac tor experiments.The four independent variab les，namely extraction tem perature，ethanol concentration，solid-liquid ratio and flash extraction time on extraction yield of Ursolic Acid were evaluated by response surface methodology（RSM）.The results showed that the op timum conditions for extrac ting Ledum Ursolic Acid were as follows：the tem perature 90℃，the ethanol concentration 84%，the solid-liquid ratio 1∶25，and the flash extraction time 3m in.Under the op timal cond itions，the extraction yield achieved 1.52%.Furthermore，the groups and content of Ursolic Acid were investigated by FTIR，extracts containing the typ ical g roup of Ursolic Acid standard，occurs of pyrolysis reaction in the temperature range of 300～390℃，the weight loss rate reached over 70%，the crystallinity of Ursolic sam p le was 64.3%，consistent w ith the ursolic acid standard，Itwas d istributed in irregular ellipsoid by SEM.

Ledum palustre L.；Ursolic Acid；flash extraction；response surface methodology；TG；X-RD

TS201.1

B

1002-0306（2015）06-0251-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.047

2014-07-21

張喬會（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品加工技術。

王建中（1951-），男，碩士，教授，研究方向：林產品加工利用。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004081）。