傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳宏基因組DNA三種提取方法比較研究

謝　婕，趙　欣，騫　宇，陳煉紅，李　鍵，索化夷，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.西南大學國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶400715；3.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067；4.西南民族大學青藏高原研究院，四川成都610041）

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳宏基因組DNA三種提取方法比較研究

謝婕1，2，趙欣3，騫宇3，陳煉紅4，李鍵4，索化夷1，2，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.西南大學國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶400715；3.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067；4.西南民族大學青藏高原研究院，四川成都610041）

微生物區(qū)系復雜，自然環(huán)境中約95%是無法用常規(guī)的培養(yǎng)方法獲得的，為了對未能培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進行研究，本實驗選用傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳，分別采用CTAB-SDS-凍融法、液氮研磨法、玻璃珠吸附法來提取宏基因組DNA，然后測得三種方法所提取的DNA的濃度、純度和片段分布狀況，并對總DNA進行16S rRNA基因片段PCR擴增。實驗結(jié)果表明，本實驗所采取的三種DNA提取方法均能提取到適于后續(xù)研究質(zhì)量的DNA，但其中液氮研磨法同時具有提取的總DNA質(zhì)量較好和步驟簡單、成本低的優(yōu)點，是提取牦牛酸乳宏基因組DNA最合適的方法。

微生物，傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳，宏基因組，DNA

牦牛在我國主要分布于四川省以及青藏高原地區(qū)，是高原地區(qū)牧民主要經(jīng)濟來源［1］。傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)［2］，還含有大量有益微生物，它們不僅能夠提高食品營養(yǎng)價值、延長保存期，還可以改善食品的功能性質(zhì)［3］，對人類健康起著至關重要的作用，正日益引起人們的重視。傳統(tǒng)上，一般采用分離、純化、培養(yǎng)、鑒定的方法來分析微生物的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)，但由于自然環(huán)境中的微生物約90%～99%是無法用常規(guī)的培養(yǎng)方法獲得的［4］，因此通過純培養(yǎng)的方法并不能真正反映環(huán)境中微生物的多樣性。為了克服傳統(tǒng)研究方法的不足，充分挖掘微生物的巨大潛能，直接以環(huán)境中微生物宏基因組DNA［5-7］為基礎，應用各種分子生物學的研究方法應運而生，為研究自然環(huán)境中微生物的多樣性及其功能提供了更全面、快速、可靠的信息，成為一條尋找新基因和基因產(chǎn)物的新途徑。

宏基組DNA是進行高通量測序技術(shù)、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）［8］等非培養(yǎng)手段研究微生物多樣性技術(shù)的基礎，因此找到一種有效的宏基因組提取方法尤為重要。目前對土壤、水體、污泥等微生物宏基因組的提取方法已有較多報道［9］，而牦牛酸乳宏基因組提取方法的研究較少。本實驗采用CTAB-SDS-凍融法、玻璃珠吸附法、液氮研磨法三種方法來提取四川省紅原縣牧民自然發(fā)酵耗牛酸奶中微生物宏基因組DNA，通過比較DNA純度、濃度和片段分布情況來分析哪種提取方法更好，或哪種方法提取的DNA更適合后續(xù)的研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牦牛酸乳采自四川省紅原縣，冰盒保藏，運輸?shù)綄嶒炇遥?℃保存；Tris-HCl、RNA酶、蛋白酶K、玻璃珠、V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1北京索萊寶生物科技有限公司；EDTA、CTAB、NaCl、Na2HPO4、NaAc成都市科龍化工試劑廠；SDS北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；其他試劑均為分析純。

H-205OR臺式高速冷凍離心機長沙湘儀儀器有限公司；MiNi紫外分光光度計島津制作所；S1000PCR擴增儀BIO-RAO；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)Gene Company Lim ited。

1.2實驗方法

1.2.1宏基因組DNA提取方法

1.2.1.1玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法參照Martin-Laurent等［10］報道的方法進行。取1.0m L發(fā)酵乳樣品于10m L離心管中，加1g酸化玻璃珠（一定量的玻璃珠，用10mmol/L的鹽酸浸泡，再放入電熱恒溫干燥箱中烘干，即得酸化玻璃珠），再加入3m L的DNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L Na2HPO4，1.5mol/L NaCl，1%CTAB，pH8.0），渦旋振蕩3m in，加0.3m L SDS（10%）和10μL蛋白酶K（10mg/m L），50℃恒溫搖床100r/m in振蕩2h。20℃10000r/m in離心10m in，取上清，用等體積V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1抽提一次，水相中加0.1倍體積的NaAc和1倍體積的冰異丙醇，20℃14000r/m in離心5m in，收集沉淀DNA，1.5m L 70%乙醇洗滌兩次，風干后用90μL TE、10μL RNA酶溶解。

1.2.1.2液氮研磨法液氮研磨法參照Murray等［11］的方法進行。取一定量發(fā)酵乳樣品加液氮凍結(jié)，研磨，直至約為100目的粉末。取1g粉末于10m L離心管中，加3m L的DNA提取液，渦旋振蕩3m in，加0.3m L SDS（10%）和10μL蛋白酶K（10mg/m L），50℃恒溫搖床100r/m in振蕩2h。20℃10000r/m in離心10m in，取上清，用等體積V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1抽提一次，水相中加0.1倍體積的NaAc和1倍體積的冰異丙醇，20℃14000r/m in離心5m in，收集沉淀DNA，1.5m L 70%乙醇洗滌兩次，風干后用90μL TE、10μL RNA酶溶解。

1.2.1.3CTAB-SDS-凍融法CTAB-SDS-凍融法參照Bourrain等［12］的方法進行。取1.0m L發(fā)酵乳樣品加3m L的DNA提取液，在液氮、65℃水浴中反復凍融三次。加0.3m L SDS（10%）和10μL蛋白酶K（10mg/m L）50℃恒溫搖床100r/m in振蕩2h，20℃10000r/m in離心10m in，取上清。將沉淀重懸于0.9m L DNA、0.1m L 20%SDS中渦旋10s，在液氮、65℃水浴中反復凍融三次，20℃12000r/m in離心10m in，取上清。收集兩次上清與等體積的氯仿混合后10000r/m in離心10min。繼續(xù)收集上清用等體積V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）= 25∶24∶1抽提一次，水相中加0.1倍體積的NaAc和1倍體積的冰異丙醇，20℃14000r/min離心5min，收集沉淀DNA，1.5m L 70%乙醇洗滌兩次，風干后用90μL TE、10μL RNA酶溶解。

1.2.2DNA相關指標的測定

1.2.2.1DNA的純度及濃度將提取DNA用紫外分光光度計測量OD260和OD280，并根據(jù)OD260/OD280比值估算純度。DNA含量（ng/m L）=50ng/m L×（OD260的校正值）×稀釋的倍數(shù)［13］。

1.2.2.2DNA片段的分布將提取出的總DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，濃度為0.8%，電壓80V，電泳1h，溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察凝膠。

1.2.316S rRNA基因片段PCR擴增在0.5m L無菌離心管中加入2.5μL 10×PCR Buffer、1μL dNTP、1μL正向引物27F（F）5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1μL反向引物1495R（R）5’-GGCTACCTTGTTACG ACTT-3’［14］、0.2μL Taq酶（2U/μL）、1μL DNA模板（50ng/μL～1μg/μL）、13.3μL ddH2O。將上述混合液稍加混勻、離心，置PCR儀上擴增。擴增循環(huán)程序為：95℃，5m in；94℃，1m in；58℃，1m in；72℃，1m in，共30個循環(huán)；72℃，7min。反應結(jié)束后，所得產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠80V電壓電泳1h，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA的OD值及濃度

應用三種提取方法得到宏基因組DNA，分別進行OD值檢測分析，結(jié)果測得OD260、OD280數(shù)值和DNA濃度見表1。

對于DNA而言，當OD260/OD280的范圍在1.7～1.9之間時，表明DNA純度好。小于1.7說明有蛋白質(zhì)污染，大于2.0說明有RNA污染或DNA已經(jīng)降解。本實驗中每個樣品的4個平行實驗結(jié)果比較接近，這表明因?qū)嶒灢僮髟斐傻臋z測誤差比較小。三種方法提取出的總DNA濃度均在200ng/μL以上，其中玻璃珠吸附法得到的DNA濃度較高，其次是液氮研磨法，最低的是CTAB-SDS-凍融法提取出的總DNA濃度。采用液氮研磨法提取基因組DNA的OD均值（OD260/OD280）都在1.8左右，CTAB-SDS-凍融法所得到DNA的OD均值（OD260/OD280）都在1.85左右，表明以上兩種方法提取的總DNA純度好。只有玻璃珠吸附法所得DNA的OD均值（OD260/OD280）在1.7及以下，原因可能是玻璃珠吸附法對乳酸菌細胞壁破碎不完全，或者提取出的DNA不純，有蛋白質(zhì)污染。

表1　DNA的濃度和純度Table 1　DNA of concentration and purity

2.2總DNA電泳分析

三種方法提取到的總DNA凝膠電泳圖如圖1所示。

圖1　總DNA0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　Total DNA 0.8%agarose gel electrophoresis figure

從圖1的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果中可以看出，3種提取方法所得到的DNA片段都在23kb以上，表明這些方法都能夠提取到DNA。但是3、4號條帶較亮，特別是4號條帶明顯亮于其他條帶，這表明液氮研磨法提取總DNA效果優(yōu)于其他兩種方法。

2.316SrRNA基因PCR結(jié)果

總DNA16S rRNA基因PCR，如圖2所示。

圖2　PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Amplified PCR product 1%agarose gel electrophoresis figure

從圖2可以看出，3個樣品均在1500bp左右處出現(xiàn)清晰明亮的條帶，這證明了本實驗中所提取得到的總DNA提取方法均適宜于后續(xù)的研究。

3　結(jié)論與討論

傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究微生物的多樣性存在很多不足，并不能正確反映微生物的多樣性，分子生物學方法克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的缺陷，在微生物多樣性方面得到了越來越多的應用。在微生物分子生物學研究中，樣品總DNA的提取是最基本也是最重要的實驗技術(shù)之一。但由于微生物的復雜多樣以及環(huán)境樣品的性質(zhì)多變，沒有一種提取DNA的方法能適用于所有的環(huán)境樣品［15］。目前，國內(nèi)外許多學者對各種微生物多樣性進行了研究，提取了各種微生物的總DNA。熊開容等［16］用多種方法的組合對活性污泥中的微生物DNA進行了提取，結(jié)果表明用凍融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法獲得的DNA最適合于酶解和PCR擴增的要求。植物總DNA的提取通常采用液氮冷凍研磨破碎細胞壁的方法提取基因組DNA［17-18］。淡瑞芳等［19］通過對植物的CTAB法進行改進，建立了一種簡單快速的提取瘤胃內(nèi)容物總DNA的方法，且獲得的瘤胃總DNA符合分子生物學的要求。Leser等［20］用氧化鋯-二氧化硅微珠破碎細胞法提取豬腸道微生物總DNA。張春林等［21］研究西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳宏基因組DNA的提取并對微生物群落多樣性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過改良的CTAB-SDS-凍融法對DNA的提取效果較佳，可直接用于后續(xù)的微生物多樣性分析，運用細菌16S rRNA-RFLP和真菌ITS-PCR相結(jié)合的方法能夠全面快速地比較分析發(fā)酵乳中的微生物多樣性。這些方法都為提取牦牛酸乳微生物總DNA提供了參考。

本實驗運用三種方法提取來自四川省紅原縣牧民家中的傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵酸乳的宏基因組DNA，并對提取結(jié)果進行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管玻璃珠吸附法得到的DNA濃度較高，但提取純度較差。CTABSDS-凍融法提取出的總DNA雖然純度好，但提取濃度相比其他方法較低，且操作比較復雜；液氮研磨法提取的總DNA純度好，濃度較高，適合后續(xù)的研究，且操作簡單、成本低，是提取發(fā)酵牦牛酸乳宏基因組DNA最合適的方法。

［1］Sheng Q，Li J，Alam M S，et al.Gross composition and nutrient profiles of Chinese yak（Maiwa）milk［J］.International Journal of Food Science&Technology，2008，43（3）：568-572.

［2］LiH，Ma Y，LiQ，etal.The chemical composition and nitrogen distribution of Chinese yak（Maiwa）milk［J］.International Journalof Molecular Sciences，2011，12（8）：4885-4895.

［3］尹勝利，杜鑒，徐晨.乳酸菌的研究現(xiàn)狀及其應用［J］.食品科技，2012（9）：25-29.

［4］李紅，周友兵，陳炳耀，等.分子生物學技術(shù)在微生物多樣性研究中的應用［J］.河北大學學報：自然科學版，2004，23（4）：450-454.

［5］Gewin V.Genomics：Discovery in the dirt［J］.Nature，2006，439（7075）：384-386.

［6］Oh H J，Cho K W，Jung I S，et al.Expanding functional spaces of enzymes by utilizing whole genome treasure for library construction［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，26（3）：241-250.

［7］Brady SF，Clardy J.Long-chain N-acylamino acid antibiotics isolated from heterologously expressed environmental DNA［J］. Journal of the American Chemical Society，2000，122（51）：12903-12904.

［8］馮美琴.宏基因組學的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（2）：415-416.

［9］微生物非培養(yǎng)技術(shù)原理與應用［M］.北京：科學出版社，2010.

［10］Martin-Laurent F，Philippot L，Hallet S，etal.DNA extraction from soils：old bias for new microbial diversity analysismethods［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67（5）：2354-2359.

［11］Murray M G，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］.Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4326.

［12］Bourrain M，Achouak W，Urbain V，et al.DNA extraction from activated sludges［J］.Current Microbiology，1999，38（6）：315-319.

［13］黃永蓮.瓊脂糖凝膠電泳實驗技術(shù)研究［J］.湛江師范學院學報，2009，30（6）：83-85.

［14］Aquilanti L，Mannazzu I，Papa R，et al.Amplified ribosomal DNA restriction analysis for the characterization of Azotobacteraceae：a contribution to the study of these free-living nitrogen-fixing bacteria［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，57（2）：197-206.

［15］滕齊輝，曹慧，崔中利，等.PCR-RFLP分析［J］.生物多樣性，2006，14（4）：345-351.

［16］熊開容，張智明，張敏.活性污泥總DNA提取方法的研究［J］.生物技術(shù)，2005，15（4）：43-45.

［17］劉小勇，田素忠.提取植物和微生物DNA的SDS-CTAB改進法［J］.北京林業(yè)大學學報，1997，19（3）：100-103.

［18］潘和平，晉玲，高天鵬，等.沙拐棗DNA提取方法改進及PCR擴增檢測［J］.草業(yè)科學，2006，23（10）：28-31.

［19］淡瑞芳，龍瑞軍，楊予海.瘤胃微生物總DNA快速提取法研究［J］.家畜生態(tài)學報，2006，27（1）：18-21.

［20］Leser TD，Lindecrona R H，Jensen TK，etal.Changes in bacterial community structure in the colon of pigs fed different experimentaldietsandafterinfectionwithBrachyspira hyodysenteriae［J］.Applied and EnvironmentalMicrobiology，2000，66（8）：3290-3296.

［21］張春林，劉文俊，張彥斌，等.西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳宏基因組DNA的提取及微生物群落多樣性分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010（4）：15-20.

Study on com parison of three extraction methods of traditional fermented yak yogurtmacro genom ic DNA

XIE Jie1，2，ZHAO Xin3，QIAN Yu3，CHEN Lian-hong4，LI Jian4，SUO Hua-yi1，2，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Engineering Technology Research Center for Characteristic Food of Chongqing，Chongqing 400715，China；3.Departmentof Biologica and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China；4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

Microflora was so com p lex that around which 95%could not be obtained by culture in conventional way.This paper selected the traditional fermented yak yogurt，and extracted the macro genom ic DNA by three methods respectively，inc luding CTAB-SDS-frozen-thawed，liquid nitrogen trituration and g lass bead adsorp tive p rocess.Then the DNA concentration，purity and fragment d istribution，and the total DNA of 16S rRNA gene PCR amp lification was tested.The result showed that all the three methods could extract the DNA suitab le for the follow-up study.But liquid nitrogen trituration method not only had the p riority of a better DNA quality，but also was sim p lest and lowest costed way com pared to the other two methods.So it was the most suitab le method to extract yak yogurtmacro genom ic DNA.

m ic roorganism；traditional fermented yak yogurt；macro genom ic；DNA

TS252

A

1002-0306（2015）06-0175-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.031

2014-05-12

謝婕（1988-），女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵微生物。

索化夷（1978-），男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵微生物。

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203009）；中央高?；緲I(yè)務費項目（XDJK2013B010）；重慶市基礎與前沿研究計劃項目（CSTC2013JCYJA80006）。