加拿大一枝黃花精油的提取及對灰霉菌抑制作用的研究

丁　月，葉仁鳳，歐昌榮，曹錦軒，邵興鋒

（寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江寧波315211）

加拿大一枝黃花精油的提取及對灰霉菌抑制作用的研究

丁月，葉仁鳳，歐昌榮，曹錦軒，邵興鋒*

（寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江寧波315211）

采用水蒸氣蒸餾法從加拿大一枝黃花中提取揮發(fā)油，通過L9（34）正交實驗研究料液比、浸泡時間、蒸餾時間對精油得率的影響。采用接觸法評價該植物的花、葉精油對灰霉菌的抑菌活性，并由掃描和透射電鏡觀察對其灰霉菌絲體和內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：浸泡時間對精油得率的影響最大，最優(yōu)提取方案為料液比1∶12（g/mL），浸泡時間3h，蒸餾時間3h。該植物的葉部和花部精油都對灰霉菌有抑制作用，抑制率與濃度呈正相關(guān)；2個部位精油處理都能導(dǎo)致菌絲變細(xì)、表面皺縮度提高；細(xì)胞壁受損且質(zhì)地疏松，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及界限模糊，細(xì)胞質(zhì)外滲。其中，該植物葉部精油的抑菌效果和對菌體的破壞能力高于花部精油。

加拿大一枝黃花，精油，灰霉，抑菌性

加拿大一枝黃花（Solidago canadensis L.）屬菊科一枝黃花屬植物，原產(chǎn)北美，于20世紀(jì)70年代作為觀賞花卉引入我國［1-2］，后在我國逐漸擴散，廣泛分布在我國華東地區(qū)［3］，成為一種區(qū)域性惡性雜草［4］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，加拿大一枝黃花體內(nèi)含有的多種活性成分，其中包括萜類、皂苷類、多酚類、聚炔類等［5］，具有消炎鎮(zhèn)痛、祛痰鎮(zhèn)咳和治療泌尿疾病等藥用價值，無明顯毒性［6-7］。精油作為一種由其植株提取的有效成分，具有廣泛生物學(xué)活性，其中含量較高的成分大香葉烯D（Germacrene D）具有明顯的抗菌活性［8］。其精油主要集中在花、葉部分［9］，尤其是9至10月加拿大一枝黃花精油抗菌性最高［10］。該精油的廣譜抗菌性使其有潛力開發(fā)成為綠色農(nóng)藥，或作為一種環(huán)境友好型的生防試劑用于果蔬防腐保鮮。

由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）導(dǎo)致的灰霉病是危害嚴(yán)重的植物病害，可造成多種果蔬的采后腐爛損失。當(dāng)前，用于防治灰霉病的藥劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、Ⅳ-苯氨基甲酸酯類、百菌清和苯氨基嘧啶類殺菌劑［11］。但由于灰霉菌極易對殺菌劑產(chǎn)生抗性，現(xiàn)今正逐步尋找其他生物防治方法來控制這一病癥。植物精油由于其綠色天然性和有效的抗菌性，正逐漸被開發(fā)作為植物源農(nóng)藥來應(yīng)對各類作物的灰霉?。?2］。目前，將加拿大一枝黃花精油運用到灰霉病防治的研究還鮮有報道。本研究從加拿大一枝黃花的提取工藝研究入手，進一步分析其葉部和花部精油對灰霉菌的抑制效果，探求精油對真菌菌絲體和超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為開展加拿大一枝黃花精油防控果蔬灰霉病的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

加拿大一枝黃花（Solidago canadensis L.）全株于2012年9月采自寧波大學(xué)校園，處理后用其花序及鮮葉提取精油；灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）由寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程微生物實驗室提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基杭州微生物試劑有限公司；Tween-80、氯化鈉、無水硫酸鈉等其他試劑均為分析純。

JY6002型電子天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ZDHW型電熱套北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型潔凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；90-3型雙向定時恒溫磁力攪拌器上海青浦滬西儀器廠；HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱寧波江南儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡（20nm E-1010真空離子濺射鍍金膜機）、HCP-2型臨界點干燥機、S-3400N型掃描電子顯微鏡、JEM-1230型透射電鏡日本日立。

1.2實驗方法

1.2.1精油的提取采集新鮮加拿大一枝黃花地上部分，分為花序和葉片兩部分，切碎，40℃干燥12h，粉碎過2號篩。準(zhǔn)確稱取粉末100g，用蒸餾水浸泡一定時間，采用水蒸氣蒸餾法進行提取。將提取的油水混合物放入分液漏斗內(nèi)靜置分層，大約30min后分離油水混合物得到粗品，用無水硫酸鈉干燥除去殘留水分后得到精油。提出的精油收集于磨口試管中，冰箱保存供試。精油得率的計算公式如下：

1.2.2正交實驗設(shè)計現(xiàn)有研究表明，在采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油時，影響其得率的幾個因素分別為藥材粒度、干燥方法、浸泡時間、提取時間及提取設(shè)備［12］。根據(jù)前期實驗的初步考察，在控制藥材粒度和干燥條件的情況下，影響水蒸氣蒸餾法提取精油得率的三個主要因素分別為料液比、浸泡時間和蒸餾時間。各因素條件參照劉繼鑫［9］、高宏建［13］的研究并結(jié)合實際條件進行設(shè)計。以加拿大一枝黃花葉片作為實驗原料進行實驗，以精油得率為考察指標(biāo)，采用3因素3水平，按L9（34）正交表排列優(yōu)化精油浸提工藝參數(shù)，因素水平設(shè)計表見表1，每組實驗重復(fù)3次。

表1　正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.3抑菌活性測定參照文獻［14］的方法，采用接觸法對兩種精油進行抑菌活性的測定：用含1% Tween-80的無菌水配制馬鈴薯培養(yǎng)基，滅菌后在無菌條件下加入精油，培養(yǎng)基內(nèi)精油的最終濃度為2.5‰、1.25‰、0.625‰，對照為含1%Tween-80的馬鈴薯培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基倒入直徑9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，每個濃度做3個重復(fù)實驗。待上述含毒培養(yǎng)基冷凝后，用接種針在培養(yǎng)皿中央接種直徑為6mm的供試菌菌塊，置于（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種后84h對B.cinerea進行培養(yǎng)皿菌落直徑的測量，并觀察菌絲的長勢，取平均值并記錄。每個菌落按十字交叉法測量兩次，取其平均代表菌落的大小，抑菌活性的計算公式如下：

抑菌活性（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組合菌落直徑×100

1.2.4菌絲體掃描電鏡觀察從已生長2d的菌落中收集孢子懸液，接種至新鮮液體培養(yǎng)基，在（28±1）℃下振蕩培養(yǎng)2d，使菌絲生長。參照文獻［15-16］的方法，收集菌絲團，分別經(jīng)0.25%的葉部精油和0.25%的花部精油處理2h。處理后的樣品經(jīng)2.5%的戊二醛在室溫下固定，后經(jīng)梯度脫水、冷凍干燥機干燥、雙面碳帶裝裱、濺射鍍膜機進行金/鈀涂層進行處理，于S-3400N掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。以正常生長2d的菌絲作為對照組。取3個平行進行觀察。

1.2.5菌絲體透射電鏡觀察經(jīng)過2d的前培養(yǎng)和2h的精油處理后（方法同1.2.4），收集菌絲團，固定后經(jīng)脫水、包埋、超薄切片、鈾鉛雙染后于JEM-1230型透射電鏡下觀察各個樣品。以正常生長2d的菌絲作為對照組。取3個平行進行觀察。

1.3數(shù)據(jù)分析

用SAS 8.0軟件One-Way ANOVA（p=0.05）進行方差分析，比較加拿大一枝黃花花部和葉部精油對B.cinerea抑制效果的差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1精油提取正交實驗分析

采用L9（34）正交實驗設(shè)計，對料液比、浸泡時間和蒸餾時間在3個不同水平上進行優(yōu)化實驗，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2可知，加拿大一枝黃花葉部精油水蒸氣蒸餾法中的料液比、浸泡時間、蒸餾時間的極差分別為0.17、0.2、0.12，各因素對精油得率的影響的主次順序為：浸泡時間＞液料比＞蒸餾時間。加拿大一枝黃花葉部精油提取的最佳工藝為A3B3C3，即料液比1∶12，浸泡時間3h，蒸餾時間3h，在此工藝下加拿大一枝黃花葉部精油的得率最高，為0.64%。

表2　正交實驗設(shè)計與結(jié)果分析Table 2　Results and analysis of the orthogonal test

2.2不同部位精油對灰霉菌絲體的抑制效果比較

從圖1可以看出，加拿大一枝黃花的葉部和花部精油對B.cinerea菌絲生長都有不同程度的抑制效果，隨著精油濃度的升高，抑菌作用增強。2.5‰濃度下加拿大一枝黃花葉部精油對B.cinerea的抑制率達36.56%，而花部精油僅達14.47%，加拿大一枝黃花葉部精油對B.cinerea菌絲生長的抑制效果要顯著優(yōu)于花部精油（p＜0.05）。

據(jù)文獻報道，加拿大一枝黃花精油中的大香葉烯D（Germacrene D）是其主要的抗菌活性成分［5，17］，其他成分如山萘酚、槲皮素等也具有較強抑菌性［18-19］。由于實驗原料采集于10月份，該階段植物葉片中的主要黃酮類成分為綠原酸、咖啡酸、槲皮素，花中主要為黃酮醇類與苷類，同時也含有較多的綠原酸和咖啡酸［20］?，F(xiàn)有研究表明，槲皮素和綠原酸都具有較好的廣譜抗菌性，而槲皮素比其苷類衍生物具有更強的生理作用［21］。此外，對除黃酮成分之外的成分研究表明，加拿大一枝黃花的大香葉烯D成分主要存在與除花序以外的植株中，10月份正是加拿大一枝黃花葉片中大香葉烯D含量最多的時期［10］。據(jù)此分析，加拿大一枝黃花葉部精油中大香葉烯D、綠原酸和槲皮素的存在可能是使其比花部精油具有較高抑菌活性的原因。在已有的研究報道表明，加拿大一枝黃花精油對部分革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及霉菌具有很強的抑菌活性［14，22］，但是未見作用于灰霉菌的研究。本研究的結(jié)果有利于進一步拓展加拿大一枝黃花精油今后的潛在利用價值。

此外需要注意的是，當(dāng)精油濃度為0.625‰時，花部精油對菌絲延長的抑制率為-21.62%，說明在較低的濃度下，加拿大一枝黃花的花部精油中可能存在某些組分如植物激素，能促進B.cinerea菌絲的生長。因此在實際的應(yīng)用過程中，需要進一步研究確定合適的使用濃度。

圖1　加拿大一枝黃花的葉、花精油對灰霉菌絲生長的抑制效果Fig.1　Inhibitory effects of essential oil from leaves and inflorescences of Solidago canadensis L.onmycelium growth of Botrytis cinerea

2.3不同部位精油對灰霉菌絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可見，對照菌絲生長旺盛，纖細(xì)直長，形態(tài)飽滿均勻，菌絲表面光滑致密，隔膜清晰；在0.25%葉部精油及0.25%花部精油處理下的B.cinerea菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯變化，菌絲表面皺縮，粗糙不平，說明菌絲體已受損。比較同濃度葉部精油和花部精油對菌絲的影響可發(fā)現(xiàn)，葉部精油對菌絲的影響更加明顯，菌絲表面皺縮度加深，菌絲變細(xì)，細(xì)胞壁變薄且嚴(yán)重變形，而花部精油對菌絲皺縮的影響相對較輕。

圖2　掃描電鏡下灰霉的菌絲形態(tài)Fig.2　Themycelial form of Botrytis cinerea under scanning electronmicroscope

2.4不同部位精油對灰霉菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可見。對照組菌絲細(xì)胞飽滿，結(jié)構(gòu)清晰，層次清楚，胞外無外滲物；細(xì)胞壁及細(xì)胞膜連續(xù)完整，細(xì)胞壁質(zhì)地致密、厚薄均勻、規(guī)則，細(xì)胞膜完整光滑，結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞基質(zhì)均勻，細(xì)胞器豐富完整，細(xì)胞核、核仁及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等清晰可見，且核膜連續(xù)完整。

經(jīng)0.25%加拿大一枝黃花葉部和花部精油處理后的菌絲，細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞壁受損且質(zhì)地疏松，界限模糊，外圍沉積少許的不明外滲物，細(xì)胞膜輪廓不清，有的細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離；細(xì)胞質(zhì)不均勻，出現(xiàn)許多空泡，組成混亂，葉部精油處理組較花部精油處理組更加明顯；細(xì)胞器界限不清，細(xì)胞核核膜消失，結(jié)構(gòu)不明顯，胞漿消化呈碎渣樣。

綜合電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加拿大一枝黃花精油對B.cinerea的破壞可能首先作用于細(xì)胞膜，引起膜的損傷、破壞和通透性改變，進而侵入細(xì)胞內(nèi)部引起細(xì)胞器的損傷，在胞內(nèi)形成空泡，影響細(xì)胞的生理機能。Shao等［23］同樣通過該方法研究茶樹油對灰霉菌的破壞機制，發(fā)現(xiàn)精油對灰霉菌的破壞首先表現(xiàn)為細(xì)胞壁皺縮、細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)、形成空泡，隨著精油濃度的增加，則會出現(xiàn)細(xì)胞壁瘤狀突起，細(xì)胞壁破裂等更加嚴(yán)重的變化。王春梅等［24］采用丁香酚處理灰霉菌絲，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

圖3　透射電鏡下灰霉的菌絲形態(tài)Fig.3　Themycelial form of Botrytis cinerea under transmission electronmicroscope

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，在實驗研究范圍內(nèi)，用水蒸氣蒸餾法提取加拿大一枝黃花葉部精油時，料液比對得率的影響最大，采用料液比1∶12（g/m L），浸泡時間3h，蒸餾時間3h時達到最高得率。抑菌實驗中，加拿大一枝黃花的葉部精油對B.cinerea表現(xiàn)出較強的抗菌活性，較低濃度下就能有效控制其生長，造成其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的損傷以及各種細(xì)胞器的破壞。

由于植物精油具有廣譜抗菌性，使用時易揮發(fā)，不易在果蔬表面殘留異味，相比化學(xué)試劑具有更高的安全性和更好的使用性，因此可以考慮將其用做為一種對抗灰霉病的果蔬保鮮劑，在較低濃度下就會表現(xiàn)出非常好的防腐效果。目前對加拿大一枝黃花的生態(tài)作用研究較多，對其化學(xué)成分的抑菌活性及作用機制的研究才剛剛起步，本實驗研究結(jié)果可為加拿大一枝黃花精油對B.cinerea的抑菌機制提供細(xì)胞學(xué)資料，為揭示其抑菌機制奠定一定的理論基礎(chǔ)，也為加拿大一枝黃花在水果采后病害生物防治上的應(yīng)用提供一些依據(jù)。

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Study on extraction of essentialoil from Solidago canadensis L.and its antifungalactivity on Botrytis cinerea

DING Yue，YE Ren-feng，OU Chang-rong，CAO Jin-xuan，SHAO Xing-feng*
（Departmentof Food Science and Engineering，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The essential oil was extrac ted by hyd rodistillation from the leaves and inflorescences of Solidago canadensis L.The orthogonalexperimentof L9（34）were used to op tim ize the extrac tion of essentialoil，inc lud ing influences of solid-liquid ratio，immersion time and distillation time.The antifungalability of flowers and leaves' essential oil on B.cinerea were investigated by contacting method，and then the changes of mycelial were observed by scanning elec tron m ic roscope（SEM）and transm ission electron m icroscope（TEM）.The results showed that immersion time was the most influential factor，and the op timal extraction method was that solidliquid ratio was 1∶12（g/m L），immersion time was 3h and d istillation time was 3h.The essentialoil from two parts of the p lant showed a good antifungal activity on B.cinerea.The treated hyphae became to be shrinking and much thinner than the controlled，the structure of cellwallwas damaged and became to be loose.The subcellular structure and its memb rane d immed and disappeared，the cytop lasm exosmosis increased.The essential oil from leaves of S.canadensis showed higher antifungaland damage ability than thatof flowers.

Solidago canadensis L；essentialoil；Botrytis cinerea；antifungalactivity

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.026

2014-07-16

丁月（1993-），女，本科，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

邵興鋒（1980-），男，博士，副教授，研究方向：食品貯藏保鮮。

浙江省科技廳公益性應(yīng)用研究項目（2013C32094）；寧波市農(nóng)業(yè)和社會發(fā)展攻關(guān)項目（2014C50084）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2012R405058）。