巴美肉羊M yHC熒光定量檢測(cè)方法的優(yōu)化

張　靜，郭月英，任　霆，程海星，王　樂(lè)，靳　燁

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

巴美肉羊M yHC熒光定量檢測(cè)方法的優(yōu)化

張靜，郭月英，任霆，程海星，王樂(lè)，靳燁*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

通過(guò)相對(duì)熒光定量的方法，以18S rRNA做管家基因，探索MyHC基因家族是否可用于巴美肉羊的研究，并確定最佳退火溫度。研究發(fā)現(xiàn)引物可用于巴美肉羊MyHC基因表達(dá)量的研究；當(dāng)退火溫度為57℃時(shí)各基因的峰值單一，Ct值最穩(wěn)定，且擴(kuò)增效率好。此方法確定的實(shí)驗(yàn)條件可以用于測(cè)定巴美肉羊MyHCmRNA表達(dá)量的分析。

肌球蛋白重鏈（MyHC），18S rRNA，熒光定量PCR

隨著人們消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)肉制品的要求已從量的需求轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)質(zhì)的提高。肉品質(zhì)成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。肉品質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的性狀，眾多因素共同決定了肉質(zhì)的優(yōu)劣，如：動(dòng)物品種、飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)狀況、屠宰時(shí)間以及基因效應(yīng)等［1］。巴美肉羊是我國(guó)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的培育肉用品種，它的出現(xiàn)緩解了我國(guó)優(yōu)質(zhì)肉用種羊嚴(yán)重不足的壓力，促進(jìn)了肉羊良種繁育和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展［2］，但關(guān)于巴美肉羊的研究卻鮮見(jiàn)。MyHC基因家族（myosin heacy chain）又稱肌球蛋白重鏈基因家族，MyHC家族的Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱx型和Ⅱb型基因分別對(duì)應(yīng)Ⅰ型（慢速氧化型）、Ⅱa型（快速氧化型）、Ⅱx型（中間型）和Ⅱb型（快速酵解型）四種肌纖維類(lèi)型［3］。大量研究表明，MyHC基因可以通過(guò)控制肌纖維的類(lèi)型來(lái)影響肉質(zhì)的優(yōu)劣。關(guān)于MyHC基因家族在魚(yú)、豬和牛這些動(dòng)物方面的研究較多，在羊特別是巴美肉羊方面的研究幾乎沒(méi)有。熒光定量是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度，從而實(shí)現(xiàn)了由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍。本實(shí)驗(yàn)以巴美肉羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，以MyHC基因家族及管家基因18S rRNA為實(shí)驗(yàn)基因，采用熒光相對(duì)定量的方法進(jìn)行mRNA相對(duì)表達(dá)量的研究，通過(guò)此實(shí)驗(yàn)確定MyHC基因在相對(duì)表達(dá)量實(shí)驗(yàn)中的最佳實(shí)驗(yàn)條件，為下一步的研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

4月齡巴美肉羊的股二頭肌選用來(lái)自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市，現(xiàn)代畜牧業(yè)示范基地（常見(jiàn)食用部位且容易取得）；RNAiso Plus、Prem ix Taq?Version2.0（Loading dye mix）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR?Prem ix Ex TaqTMII、pMD19-T Vector Kit大連寶生物工程有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit AXYGEN、Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNase-free水北京天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯仿分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、無(wú)水乙醇分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)上海智城分析儀器制造有限公司；Eppendorf 5430R低溫臺(tái)式冷凍離心機(jī)、移液槍1000、200、100、20、10、2.5μLEppendorf生物公司，德國(guó)；BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀

北京百晶生物技術(shù)有限公司；水平電泳槽北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白分析儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀（CFX96TMReal-Time PCR Detection System）Bio-rad，美國(guó)；普通PCR儀App lied Biosystems（AB），美國(guó)；R134A生化培養(yǎng)箱SHEL LAB；ZWYR-240搖床上海智城儀器。

1.2RNA用樣品處理

將宰后1h內(nèi)巴美肉羊的股二頭肌肌肉100mg左右放入2m L無(wú)酶管中，并迅速將其投入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后，置于-80℃冰箱中保存。將采回的肉樣進(jìn)行RNA提取，并進(jìn)行表達(dá)量的研究，從而得出巴美肉羊中MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx及管家基因18S rRNA的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.3總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

1.3.1總RNA的提取總RNA的提取按照RNAiso Plus、Prem ix Taq?Version2.0（Loading dye m ix）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA質(zhì)量，最后置于-80℃冰箱保存。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄測(cè)定RNA的OD值和濃度，OD260/ OD280均在1.7～2.0范圍，稀釋成約1000ng/μL的濃度。反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄后的默認(rèn)cDNA濃度為50ng/μL。

1.4引物的設(shè)計(jì)與合成

管家基因18S rRNA、MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx引物引用參考文獻(xiàn)［4］，MyHCIIb引物由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)郭月英提供，由上海生工生物工程有限公司合成引物。引物信息如表1所示。

表1　實(shí)時(shí)定量引物Table 1　Primers of real-time PCR

1.5實(shí)驗(yàn)方法

熒光定量PCR按照SYBR?Premix Ex TaqTMII說(shuō)明書(shū)的CFX96TMReal-Time PCR Detection System二步法操作。為了篩選最佳反應(yīng)條件，本實(shí)驗(yàn)做了溫度梯度實(shí)驗(yàn)，溫度梯度范圍為52～61℃，最終選擇的最佳退火溫度為57℃，反應(yīng)條件為：

1.6PCR產(chǎn)物的膠回收純化

用1.2%的瓊脂糖凝膠做膠回收純化，膠回收純化操作步驟按照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7目的基因的克隆

1.7.1目的基因的連接目的基因與pMD19-T連接載體連接，操作步驟按照pMD19-T Vector Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7.2目的基因的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，操作步驟按照Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7.3篩選陽(yáng)性克隆及測(cè)序?qū)⒂修D(zhuǎn)化好的感受態(tài)細(xì)胞的菌液200μL均勻涂布于含有AMP、IPTG和x-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上，把平板置于37℃至液體被吸收，倒置平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。選取單個(gè)漂亮的陽(yáng)性菌落放入裝有10μL滅菌水的PCR管中，1μL用于菌落PCR，菌落PCR的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，把條帶清晰明亮且單一的菌落PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的剩余9μL的帶有菌落的滅菌水加入含有AMP和甘油的LB液體培養(yǎng)基中，送去測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1RNA提取結(jié)果

經(jīng)凝膠成像結(jié)果如圖1，由圖1可看出28、18和5S處的三條帶清晰明亮，基本沒(méi)有降解。用核酸蛋白分析儀測(cè)得OD260/OD280均在1.7～2.0之間，沒(méi)有被DNA或蛋白污染（當(dāng)OD260/OD280小于1.7時(shí)，說(shuō)明被蛋白污染；當(dāng)OD260/OD280大于2.0時(shí)，說(shuō)明被DNA污染），可用于反轉(zhuǎn)錄及熒光定量。

圖1　RNA提取結(jié)果Fig.1　The resultof total RNA

2.2PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2。

圖2　PCR產(chǎn)物結(jié)果圖Fig.2　The result of PCR

從圖2可以看出，MyHCⅠ、Ⅱa、Ⅱb和Ⅱx基因和18S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后條帶單一且清晰明亮，無(wú)引物二聚體和其他雜質(zhì)產(chǎn)生。通過(guò)與Marker條帶比較，其大小與所設(shè)計(jì)引物相符，說(shuō)明引物符合實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)要求。

2.3測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)陽(yáng)性菌液的測(cè)序比對(duì)，證實(shí)所設(shè)計(jì)引物即為目的基因引物，各引物均符合實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4溶解曲線分析

如圖3～圖7所示，分別為MyHCII x、II a、II b，I基因和管家基因18S rRNA在退火溫度為57℃時(shí)的溶解曲線圖。溶解曲線頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度為溶解溫度（Tm），可部分代表序列的特異性。由圖3～圖7可知，溶解曲線的峰值單一，重復(fù)性好，說(shuō)明無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；Tm分別為86、85.3、81.5、90和84℃，數(shù)值穩(wěn)定且均位于80～90℃之間，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)出現(xiàn)雜峰時(shí)，可通過(guò)改變引物濃度，退火溫度和鎂離子濃度來(lái)解決問(wèn)題；若仍然有雜峰，說(shuō)明引物特異性差，要換特異性好的引物。

圖3　MyHC IIx溶解曲線Fig.3　Melting curve ofMyHC IIx

圖4　MyHC IIa溶解曲線Fig.4　Melting curve ofMyHC IIa

圖5　MyHC IIb溶解曲線Fig.5　Melting curve ofMyHC IIb

圖6　MyHC I溶解曲線Fig.6　Melting curve ofMyHC I

圖7　18S rRNA溶解曲線Fig.7　Melting curve of 18S rRNA

2.5擴(kuò)增曲線分析

如圖8～圖12所示，分別為MyHCII x、IIa、IIb、I基因和管家基因18S rRNA在退火溫度為57℃時(shí)的擴(kuò)增曲線圖。理論上擴(kuò)增曲線為2n的曲線圖，但實(shí)際反應(yīng)中呈“S”型，反應(yīng)前的基線相當(dāng)于準(zhǔn)備時(shí)間，如溫度升高或雙鏈變性等，指數(shù)期開(kāi)始復(fù)制，平臺(tái)期是由于底物消耗完所致，因此為“S”型。其中“S”型曲線與熒光閾值的交點(diǎn)為ct值，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。由圖8～圖12可知，擴(kuò)增曲線成典型“S”型，拐點(diǎn)清晰，指數(shù)期明顯，平臺(tái)期平行性好，無(wú)掃尾現(xiàn)象，每條擴(kuò)增曲線的重復(fù)性好；平行樣的ct值差異小于0.5，重復(fù)性好，ct值的平均值分別為14.03、17.00、13.97、18.20和10.63，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8　MyHC IIx擴(kuò)增曲線Fig.8　Quantification curve ofMyHC IIx

圖9　MyHC IIa擴(kuò)增曲線Fig.9　Quantification curve ofMyHC IIa

圖10　MyHC IIb擴(kuò)增曲線Fig.10　Quantification curve of MyHC IIb

圖11　MyHC I擴(kuò)增曲線Fig.11　Quantification curve ofMyHC I

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

分別以2倍梯度將cDNA稀釋成5個(gè)濃度，經(jīng)過(guò)熒光定量分析得出表2。

圖12　18S rRNA擴(kuò)增曲線Fig.12　Quantification curve of 18S rRNA

表2　MyHC和18SrRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2　Standard curve of MyHC and 18S rRNA

經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR儀分析得MyHCⅡx、Ⅱa、Ⅱb、Ⅰ和18S rRNA的擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)性系數(shù)（R2）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（y）。由表2可知MyHCⅡx、Ⅱa、Ⅱb、Ⅰ和18S rRNA各基因的相關(guān)系數(shù)分別為0.995、0.997、0.998、0.994和0.993均大于0.99，故相關(guān)性好；擴(kuò)增效率分別為106.9%，96.8%，96.5%，93.0%和108.2%，均位于90%～110%之間，說(shuō)明擴(kuò)增效率好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3　結(jié)論與討論

結(jié)果顯示，MyHC基因家族及管家基因18S rRNA經(jīng)相對(duì)熒光定量實(shí)驗(yàn)得到的溶解曲線均在80～90℃范圍內(nèi)出峰，平行樣的溶解溫度相同，峰值單一，沒(méi)有雜峰，重復(fù)性好，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；擴(kuò)增曲線成典型“S”型，平臺(tái)期平行性好，無(wú)掃尾現(xiàn)象，平行樣的ct值差異小于0.5，重復(fù)性非常好；標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性系數(shù)全部大于0.99，擴(kuò)增效率介于90%～110%之間，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性非常好，熒光曲線能夠準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增［5］。由上述可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線中相關(guān)系數(shù)接近1，擴(kuò)增效率為90%～110%，實(shí)驗(yàn)符合通過(guò)2-△△Ct方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異［6-7］的條件。故此相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量方法可用于巴美肉羊MyHC基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定，從而為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

能夠影響肉品質(zhì)的基因有很多，例如MRFs家族又稱生肌調(diào)節(jié)因子基因家族，此家族基因能夠作用于整個(gè)肌肉生成的過(guò)程［8］；MSTN又稱肌肉生成抑制素，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能夠影響產(chǎn)肉率，改善肉質(zhì)性狀的基因［9］；CAST（calpastatin）基因又稱鈣蛋白酶抑制蛋白，是與嫩度密切相關(guān)的基因［10］，諸如此類(lèi)的基因還有很多。MyHC基因家族（myosin heacy chain）又稱肌球蛋白重鏈基因家族，MyHC基因家族在哺乳動(dòng)物中有8種亞型，均由獨(dú)立的基因編碼。Weydert等（1983）研究說(shuō)明，小型嚙齒動(dòng)物的MyHC只有四種亞型分別為MyHCⅠ、Ⅱa、Ⅱx/d和Ⅱb型［11］，在人、豬［12］和牛中也有相同結(jié)論。MyHC家族的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型基因分別對(duì)應(yīng)Ⅰ（慢速氧化型）、Ⅱa（快速氧化型）、Ⅱx（中間型）和Ⅱb（快速酵解型）四種肌纖維類(lèi)型［3］。大量研究表明，MyHCⅠ的mRNA表達(dá)量越高，即Ⅰ型肌纖維含量高的肉質(zhì)優(yōu)良，鮮嫩多汁，口味極佳［5，13］；相反，IIb型纖維似乎與較差肉質(zhì)有關(guān)［14-15］，IIb型肌纖維的增加甚至可能導(dǎo)致PSE肉的產(chǎn)生［16］。由上述可知此家族基因與肌纖維有著極其密切的關(guān)系，而肌纖維的類(lèi)型又是影響肉品質(zhì)的重要因素之一，也就是說(shuō)MyHC基因可以通過(guò)控制肌纖維的類(lèi)型來(lái)影響肉質(zhì)的優(yōu)劣，故MyHC家族的Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型基因的mRNA表達(dá)能準(zhǔn)確、客觀地評(píng)價(jià)肉品質(zhì)量。

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Optim ization of the detection of the fluorescentquantitative PCRmethod of the meat quality gene MyHC in BaMeisheep

ZHANG Jing，GUO Yue-ying，REN Ting，CHENG Hai-xing，WANG Le，JIN Ye*
（Collage of Food Science and Engineering Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The op tim izing reac tion condition ofMyHCwas found by real-time PCR，and 18S rRNAwas housekeep ing gene.The result showed that these p rimers could be used in the searching MyHC gene in BaMei sheep. Besides，when the PCR annealing temperature was 57℃，the peak of PCR melting curve was sing le，the cyc le threshold was at the same leveland the efficiency of PCR was high.So thismethod could be used in searching mRNA exp ression of the meatquality gene MyHC in BaMeisheep.

MyHC；18S rRNA；real-time PCR

TS251.1

A

1002-0306（2015）06-0053-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.002

2014-06-16

張靜（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

靳燁（1964-），男，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)。

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31160330）；國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31360393）。