趕黃草與黃芩不同配比對病毒性肝炎C3H/HeJ小鼠的影響

翁金月　樊建霜王蓉蓉　俞志敏

趕黃草與黃芩不同配比對病毒性肝炎C3H/HeJ小鼠的影響

翁金月樊建霜★王蓉蓉俞志敏

目的 本文擬建立成熟慢性病毒性肝炎的動物模型，探討趕黃草與黃芩不同配比對病毒性肝炎的影響，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。方法 建立C3H/HeJ小鼠病毒性肝炎模型，采用試劑盒檢測模型組、趕黃草組、黃芩組、趕黃草配黃芩1∶1組、1∶2組、1∶3組各給藥組小鼠血清ALT、AST、STB、TP指標(biāo)的含量變化以及采用光學(xué)顯微鏡觀察模型組和各給藥組小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)改變；采用免疫組織化學(xué)圖像分析法測定各組肝組織COX-2的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組的肝組織呈炎性病理改變，肝臟指數(shù)顯著降低，血清中ALT、AST、STB含量顯著升高，TP含量顯著下降。與模型組比較，趕黃草組、趕黃草配黃芩1∶1組、1：2組、1∶3組小鼠肝組織炎癥、纖維化等明顯減輕，血清中的AST、ALT、STB含量顯著降低；趕黃草組、趕黃草配黃芩1∶1組、1∶2組血清TP含量顯著升高。COX-2的表達(dá)結(jié)果顯示，空白組肝細(xì)胞僅見少量陽性表達(dá)，與空白組比較，模型組肝組織中COX-2的表達(dá)顯著增強；與模型組比較，各治療組肝組織中COX-2表達(dá)均明顯低于模型組，其中趕黃草配黃芩1：2組的表達(dá)最弱。結(jié)論 趕黃草能顯著改善小鼠肝炎的病變，黃芩有改善其炎性病變的趨勢，二者配伍后，尤其當(dāng)黃芩2倍于趕黃草時，能顯著緩解其肝炎病變，其機制可能與降低COX-2的表達(dá)有關(guān)。提示臨床治療病毒性肝炎用藥，黃芩2倍用量于趕黃草效果最佳。

趕黃草 黃芩 配伍 病毒性肝炎

現(xiàn)代研究表明，趕黃草具有清熱解毒、退黃化濕、活血散瘀、利水消腫的功效，其有效成分沒食子酸和槲皮素等具有抗乙肝病毒和保肝作用，臨床上可用于酒精性肝損傷，乙型肝炎等的治療［1］。黃芩具有保肝、利膽、抗肝炎病毒的藥理作用，常用作病毒性肝炎的輔助用藥。作者通過采用3型鼠肝炎病毒（MHV-3）感染C3H/HeJ小鼠，建立成熟的具有病毒感染過程的慢性病毒性肝炎模型［2］，比較其與趕黃草治療組、黃芩治療組、趕黃草與黃芩不同配比治療組小鼠血清生化指標(biāo)以及肝組織COX-2表達(dá)的變化，研究趕黃草與黃芩配伍對于改善慢性病毒性肝炎的理論基礎(chǔ)，為臨床合理治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 （1）動物：6～8周SPF級C3H/HeJ小鼠，雌性，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。喂養(yǎng)2周可用于實驗。（2）試劑：純化鼠3型肝炎病毒（MHV-3病毒），液氮保存，濃度為106 PFU/ml。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒、總蛋白（TP）試劑盒、總膽紅素（STB）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；兔抗人單克隆COX-2抗體、DAB顯色試劑盒、HE染色劑、Masson三色染色劑均購自武漢博士德；生理鹽水購自浙江民生藥業(yè)有限公司。（3）儀器：全自動生化儀（日本日立）；BP211D 萬分之一電子分析天平（德國Sartorius）；CX21 型顯微鏡（日本OLYMPUS）；酶標(biāo)定量測定儀（Thermo Multiskan AsCant公司）；離心機（上海醫(yī)療器械廠）；Image-Pro Plus 5.0 圖像分析軟件（美國Media Cybernetics）；YB-6D型生物組織石蠟包埋機（湖北亞光有限公司）。（4）藥材：趕黃草、黃芩（均購于浙江溫州新特醫(yī)藥有限公司），趕黃草經(jīng)作者鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草的干燥地上部分；黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根。

1.2方法 （1）造模：取 C3H/HeJ小鼠70只，體質(zhì)量18～22g，按體重隨機分為空白組、模型組、趕黃草組、黃芩組、趕黃草配黃芩1：1組、1：2組、1：3組，共7組，各10只，將純化MHV-3 病毒進行稀釋，以10PFU/200μl對模型組及各給藥組小鼠進行腹腔注射，觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)以及各組血清生化指標(biāo)的變化。（2）藥液制備：①趕黃草、黃芩藥液制備： 取趕黃草、黃芩各50g，分別加10倍水浸泡30min，武火煮沸，文火繼續(xù)煎煮20min，過濾，減壓濃縮至100ml，最終濃度為0.5g/ml。②趕黃草與黃芩不同配比各組藥液的制備： 取趕黃草3份，各50g，基于①的制備條件，分別加入黃芩50g、100g、150g制備成100ml藥液，最終濃度分別為1.0g/ml、1.5g/ml、2.0g/ml。將上述藥液分裝，置-20℃冷凍，備用。

1.3藥物治療及標(biāo)本采集 小鼠于病毒感染15d后，給藥組每只小鼠按10ml/kg 藥物灌胃，空白組和模型組給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥5d，2次/d，早晚各1次，末次給藥60min后，眼眶取血，靜置30min后以3000 r/min離心10min，收集上清血清，-20℃凍存?zhèn)溆?，采血后以頸椎脫臼法處死小鼠，快速取出部分肝臟組織，以10%中性福爾馬林固定，切片，HE染色法觀察肝臟病理的總體形態(tài)變化，Masson三色染色法觀察膠原、網(wǎng)狀纖維在纖維化形成過程中的變化及判斷肝纖維化程度，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4肝組織COX-2蛋白水平的表達(dá) 將小鼠肝組織固定24h，脫水、石蠟包埋切片，置玻片上烘干，脫蠟，梯度酒精補水，分別以蒸餾水和PBS緩沖液沖洗；再將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中加熱至沸騰，停沸5min，再重復(fù)2次，冷卻后以PBS沖洗3次，每次5min，滴加50μl 3%過氧化氫，室溫孵育10min，PBS沖洗，滴加50μl非免疫性動物血清，室溫孵育，10min后棄去血清，加COX-2一抗孵育2h后加入50μl生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育20min，再滴加50μl鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，孵育20 min，沖洗，滴加100μl DAB顯色液，顯色反應(yīng)3～10 min，脫水之后封片即可。以Image-Pro Plus 5.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件檢測每組細(xì)胞陽性染色的IOD值，每張圖片選取5個IOD值的均值表示COX-2表達(dá)的相對量。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況及肝組織形態(tài)變化 小鼠感染MHV-3病毒4～6d便開始出現(xiàn)精神不振，并伴有食欲減退；感染后15d進入穩(wěn)定期。造模小鼠肉眼見肝臟體積略大，表面粗糙，局部有囊腫，空白組小鼠肝臟HE染色后，可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞間連接緊密，肝索排列整齊，肝細(xì)胞胞質(zhì)均勻，門管區(qū)無明顯炎細(xì)胞浸潤；而模型組小鼠肝臟HE染色后可見不同程度損傷，有的表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松，以中央靜脈周圍為主，肝索排列擁擠、紊亂，偶見點狀或小灶壞死，門管區(qū)見淋巴細(xì)胞浸潤等炎癥改變，嚴(yán)重者表現(xiàn)為肝臟萎縮，但肝臟組織結(jié)構(gòu)基本完整，在門管區(qū)和小葉中央有少量的膠原纖維、小范圍片狀壞死等；趕黃草組、各配伍組肝細(xì)胞的水腫、壞死及炎細(xì)胞浸潤等形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。

2.2對肝臟指數(shù)的影響 見表1。

表1　趕黃草與黃芩不同配比對小鼠病毒性肝炎肝指數(shù)的影響（±s）

表1　趕黃草與黃芩不同配比對小鼠病毒性肝炎肝指數(shù)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

組別給藥劑量（g/kg）肝臟指數(shù)（mg/10g）空白組生理鹽水5.12±0.23△模型組生理鹽水4.33±0.47*趕黃草組55.57±0.20△△黃芩組54.92±0.16△趕黃草配黃芩1：1組104.78±0.32趕黃草配黃芩1：2組155.37±0.15△△趕黃草配黃芩1：3組204.81±0.17

2.3含藥血清指標(biāo)性成分的變化 與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、STB明顯升高，TP顯著下降；與模型組比較，趕黃草組、趕黃草配黃芩1：1組、1：2組、1：3組小鼠血清中的ALT、AST、STB含量顯著降低，黃芩組有降低趨勢；對TP的研究中，趕黃草組、趕黃草配黃芩1：1組、1：2組含量顯著升高，黃芩組、趕黃草配黃芩1：3組有升高趨勢。

2.4肝組織COX-2蛋白表達(dá) 肝組織中COX-2的陽性表達(dá)以胞漿為主，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒（DAB顯色）為陽性表達(dá)，空白組肝細(xì)胞僅見少量陽性表達(dá)，模型組肝組織中COX-2的表達(dá)明顯增強，各治療組肝組織中COX-2表達(dá)均明顯低于模型組（P＜0.05），其中趕黃草配黃芩1：2組的表達(dá)最弱。

3　討論

病毒性肝炎是由幾種不同的噬肝病毒（肝炎病毒）引起的常見傳染病，具有傳染性強、發(fā)病率高等特點，部分可發(fā)展為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害人類健康。趕黃草主治黃疸、水腫等［3］，雖未被藥典收錄，但由于其顯著的療效，長期以來是苗族治療肝病的常用藥，被譽為“神仙草”［4］。其有效成分黃酮類、甾體類化合物、有機酸類等均能抑制肝損傷［5］，并對慢性肝炎有顯效［6］。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，臨床主要用于濕溫、黃疸等癥［7］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩煎劑能顯著降低CCl4造模小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和琥珀酸脫氫酶（SDH）活性，且其降低程度與藥物劑量呈量效關(guān)系，說明黃芩具有良好的保護CCl4致大鼠急性肝損傷的作用［8］?？梢娳s黃草與黃芩均有護肝作用，研究二者配伍使用能否增強其護肝作用具有一定的實用性，為臨床治療慢性病毒性肝炎提供新的思路。

關(guān)于肝炎動物模型方法較多，但均缺乏染病的自然過程，與人類慢性病毒性肝炎的發(fā)病過程有較大差異。早期研究發(fā)現(xiàn)，采用MHV-3腹腔注射于小鼠體內(nèi)，建立具有病毒感染過程的慢性病毒性肝炎模型［2］，但敏感Balb/cJ小鼠感染MHV-3后發(fā)展為暴發(fā)性肝炎，并在5～7d內(nèi)全部死亡，而耐受A/J小鼠感染MHV-3后則無任何臨床癥狀［9］。C3H/HeJ屬于近親繁殖的小鼠，對MHV-3敏感性適中，且其重復(fù)性良好，能彌補其他動物模型的局限性。造模15d后，出現(xiàn)類似于人類慢性病毒性肝炎的表現(xiàn)，血生化檢測提示AST、ALT、STB顯著升高，且AST/ALT比值＞1，說明小鼠肝已有實質(zhì)性的損害，同時伴TP下降，提示造模成功。

當(dāng)肝細(xì)胞受損時，胞漿內(nèi)的ALT與AST釋放入血漿，致使血清中轉(zhuǎn)氨酶含量升高［10］。膽紅素（STB）是判定黃疸的重要依據(jù)，也是肝功能的重要指標(biāo)［11］，當(dāng)肝臟病變時，血清中總膽紅素升高。本資料結(jié)果顯示，與模型組比較，趕黃草組、趕黃草配黃芩1∶1組、1∶2組、1∶3組小鼠肝細(xì)胞水腫、壞死及炎細(xì)胞浸潤明顯減輕，肝臟指數(shù)亦較模型組顯著升高；血清中的AST、ALT、STB含量較模型組顯著降低，黃芩組僅有降低趨勢；以趕黃草及其配伍組的血清中三者含量降低最為顯著，提示其能明顯緩解肝細(xì)胞的損傷從而使肝功能得到恢復(fù)。造模成功后，小鼠肝臟合成蛋白質(zhì)的能力下降，造成TP水平降低。在本研究中，趕黃草組、趕黃草配黃芩1∶1組、1∶2組TP含量較模型組顯著升高，黃芩組、趕黃草配黃芩1∶3組有升高趨勢，說明趕黃草可使肝臟合成蛋白質(zhì)能力基本恢復(fù)正常。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶（COX）的誘導(dǎo)酶COX-2在正常的肝臟組織中多不表達(dá)，但在慢性肝炎、肝硬化中均有表達(dá)［12,13］，本資料中，空白組肝細(xì)胞僅見少量陽性表達(dá)，模型組肝組織中COX-2的表達(dá)明顯增強，各治療組肝組織中COX-2表達(dá)均明顯低于模型組（P＜0.05），其中趕黃草配黃芩1∶2組的表達(dá)最弱，說明趕黃草配伍黃芩可能通過降低肝組織COX-2表達(dá)減輕MHV-3小鼠模型的肝臟損害。

綜上所述，趕黃草配伍黃芩治療后可以明顯改善病毒性肝炎模型小鼠的肝損傷，在各配伍組中，趕黃草與黃芩的配伍比例均有1∶1組、1∶2組、1∶3組，說明其穩(wěn)定性較好，且趕黃草配伍黃芩1∶2組的作用趨勢明顯優(yōu)于1∶1組、1∶3組，提示黃芩2倍用量于趕黃草改善肝損傷的作用最佳。但本研究僅從二者配伍方面考察其作用效果，二者以何化學(xué)部位發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)以及如何發(fā)揮作用的機制還需進一步研究。

1 胡楊洋,王勝鵬,陳銳娥,等.趕黃草的藥學(xué)研究和應(yīng)用.中藥藥理與臨床,2012,28（3）：136～139.

2 覃小敏,張江國,蘇凱,等.慢性病毒性肝炎小鼠動物模型的建立及其特征分析.中國病毒學(xué),2006,21（5）：417～420.

3 何述敏,李敏,吳眾,等.扯根菜的研究進展.中草藥,2002,33（6）：附5～6.

4 宋麗,臧志和,廖洪利,等.趕黃草的研究進展.西南軍醫(yī),2007,9（2）：87～88.

5 周永紅.大鼠藥物性肝損害免疫機制的研究及保肝藥物療效的觀察.河北醫(yī)科大學(xué),2009.45～50.

6 唐榮珍.肝蘇顆粒治療慢性乙型肝炎療效觀察.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2001,11（4）：225～226.

7 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010.282～283.

8 羅德生,鄭紅花,羅麗丹,等.黃芩煎劑對四氯化碳致大鼠急性肝損傷的保護作用.陜西中醫(yī),2004,25（2）：184～185.

9 Yokomori K, Stohlman S A, Lai M M. The detection and characterizeation of multiple hemagglutinin-esterase（HE）-defective virusesin the mouse brain during subacute demyelination induced by mousehepatitis virus . Virology, 1993,192（1）： 170～178.

10 張麗杰.血清轉(zhuǎn)氨酶的測定及臨床意義.中國醫(yī)藥指南,2012, 10（9）：298～299.

11 李敏遐,候燕明,林冬云.外周動靜脈同步換血療法應(yīng)用于新生兒高膽紅素血癥的臨床效果觀察.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,38（13）：2616～2617.

12 Cheng J, Imanishi H, Iijima H, et al. Expression of cyclooxy genase 2 and cytosoli phospholipase A2 in the liver tissue of patients with chronichepatitis and liver cirrhosis. HepatolRes, 2002, 23（3）：185～195.

13 Cheng AS, Chan HL, Leung WK, et al. Expression of HBx andCOX-2 in chronic hepatitis B, cirrhosis and hepatocellularcarcinoma： implication of HBx in upregulation of COX-2.Mod Pathol,2004,17（10）：1169～1179.

Objective To construct the mice model of chronic virus hepatitis and to study the influence of Penthorum，Penthorum and Scutellariae with different proportion on the model of chronic virus hepatitis. Methods All the mice were divided into Penthorum group，scutellariae group，Penthorum with Scutellariae 1∶1group，1∶2 group and 1∶3 group seven different groups，then established the model of C3H/HeJ mice institute of viral hepatitis；Taking use of kits to detect the content of changes in groups' mice serum ALT，AST，STB，of TP index and the morphological changes of mice liver；Using the immunohistochemical image method to detect the expression of cox-2. Results Compared with the blank group，the liver tissue of model group had infl ammatory pathological change，the liver index decreased signifi cantly，and there were signifi cant elevated in serum ALT，AST，STB，while TP content decreased signifi cantly；Compared with model group，ALT，AST，STB content in mice serum of Penthorum group，Penthorum with Scutellariae 1：1group，1∶2 group and 1∶3 group decreased significantly；in the study of TP，the content of Penthorum group，Penthorum with Scutellariae 1∶1 group，1∶2 group increased signifi cantly. The research of expression of COX-2 showed that，the expression of blank group had only a small amount of positive result；Compared with the blank group，the expression of COX-2 in liver tissue of model group was signifi cantly enhanced；Compared with model group，the expression of COX-2 in treatment group were signifi cantly lower，and the expression of Penthorum with Scutellariae 1∶2 group was the weakest. Conclusion Penthorum can signifi cantly improve the symptoms of hepatitis in mice，Scutellariae has a tendency to improve its infl ammatory symptoms，when both two compatible used，especially scutellaria 2 times than Penthorum，could signifi cantly relieve the symptoms. During the clinical medication，dosage of Scutellariae twice than Penthorum could be better.

Penthorum Scutellariae Compatibility Viral hepatitis

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（翁金月）325000 浙江省溫州市中醫(yī)院（樊建霜）325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（王蓉蓉）325000 浙江省溫州市新特醫(yī)藥有限公司（俞志敏）